基因工程蓝细菌产甘油葡萄糖苷潜力研究

摘要

甘油葡萄糖苷（Glucosylglycerol），是一类由甘油分子与葡萄糖分子以糖苷键结合的物质，是天然渗透压抵抗分子。其还是一种大分子稳定剂，可用于蛋白质药物等的长期保存；更是一种良好的化妆品添加剂，具有保湿，抗氧化和抗衰老等功效。研究发现甘油葡萄糖苷具有治疗过敏性呼吸系统疾病等多种人体保健功效。由于遗传改造方便、生长速度较快，近年来蓝细菌作为光合细胞工厂，用于合成氢气、乙醇、乙烯、异戊二烯、乳酸、蔗糖、脂肪酸、脂肪醇和脂肪烃等多种生物燃料和化学品。虽然这些研究引起了学术界和工业界的广泛关注，但是由于大多数产品价值和产率较低，因此目前仍处于研发阶段。在这种情况下，发展一种利用蓝细菌生产高附加值产物（如甘油葡萄糖苷）的技术路线，将更具可行性和潜力，也将推动蓝细菌光合生物合成技术路线的产业化应用。
　　本研究通过基因工程手段，对蓝细菌从甘油葡萄糖苷代谢途径进行改造和培养条件进行优化，探索其高效分泌甘油葡萄糖苷的潜力。该研究主要内容和结果如下：
　　第一，优化培养聚球藻PCC7002野生型培养条件，比较了不同培养基浓度培养和不同盐浓度下胁迫，测定不同条件下野生株胞内甘油葡萄糖苷积累量。实验结果表明，野生株胞内甘油葡萄糖苷积累量在900mM NaCl盐胁迫时最高，约为0.6g/L。然后在三个不同A+培养基浓度条件下分别培养聚球藻Synechococcus sp.PCC7002，在2×A+培养基,900mM NaCl盐胁迫下，得到胞内GG产量最高，约为0.85g/L。与1×A+培养基胞内GG产量比较提高了约66.7％。
　　第二，敲除聚球藻PCC7002甘油葡萄糖苷转运蛋白基因ggtCD，将聚球藻PCC7002突变株ΔggtCD在900 mM NaCl胁迫6后天测得总甘油葡萄糖苷积累量约为1.6g/L，野生型在盐胁迫下甘油葡萄糖苷积累量约0.85g/L，与野生藻株相比，ΔggtCD突变株合成甘油葡萄糖苷总量提高了约2倍。PcpcB启动子驱动ggpS基因在ΔggtCD藻株过量表达,盐胁迫下甘油葡萄糖苷积累量约2.15g/L，与ΔggtCD突变株相比，该过表达突变株甘油葡萄糖苷总量提高了约34%。
　　第三，琼脂胶封装下蓝细菌细胞每个生长周期分泌GG产量均不低于液体培养方式；而且琼脂胶封装下蓝细菌细胞能够完成5个培养周期（30天），比液体培养方式完成了更多的培养周期和获得更高的总GG产量，5个培养周期总共得到GG约为5.4g/L。
　　第四，来源于集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7002的ggpS基因分别在集胞藻PCC6803突变株ΔΔ藻株中得到过表达，虽然这一改造未能进一步提高GG的合成，但是显著提高了甘油的合成。相关实验结果进一步证实了GG合成和甘油合成的偶联关系，为将来进一步基因工程改造集胞藻以提高GG和甘油合成指明了方向。