葛根素减弱热应激对牛睾丸支持细胞的氧化损伤和凋亡及其机制

摘要

热应激会导致细胞活性氧（ROS）产生增加，引起细胞氧化损伤和凋亡增加。葛根素（Puerarin）是传统解热中药葛根的活性成分，其在热应激条件下对细胞的保护作用还未被证实。本试验通过葛根素预处理bSCs探讨热应激时葛根素对bSCs的抗氧化和抗凋亡作用，并探讨其分子调节机制。试验一，原代培养、鉴定牛睾丸支持细胞，并用CCK-8法筛选葛根素试验浓度；设对照组（34℃），热应激组（42℃），葛根素（15μM）组，热应激加葛根素（15μM）组，分别测定细胞内活性氧（ROS）水平，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活力以及丙二醛（MDA）的含量。试验二，检测葛根素对热应激下bSCs的线粒体凋亡途径的影响。依次检测Bax/Bcl-2基因和蛋白变化，线粒体膜电位变化，细胞色素C（cyto-c）转移，caspase-3基因、蛋白和活性变化以及细胞凋亡率的变化。试验三，分别用qRT-PCR和Western blot检测Hsp72 mRNA和蛋白的表达。
　　结果显示，试验一：原代培养的牛睾丸支持细胞生长良好，RT-PCR检测可见SCF mRNA表达，细胞免疫荧光染色检测到支持细胞特异性蛋白FasL表达明显，表明分离培养的细胞为睾丸支持细胞；与34℃对照组比较，1~30μM葛根素对支持细胞活力具有不明显的促进作用，葛根素浓度超过60μM时出现细胞毒性，且120μM的葛根素显著降低细胞活性(P<0.01)；与42℃热应激组比较，添加0~30μM葛根素后细胞的存活率显著升高，且15μM葛根素效果最好(P<0.01)；与42℃热应激组比较，15μM葛根素能够显著降低细胞内ROS水平(P<0.01)，显著增加细胞SOD(P<0.05)、CAT(P<0.01)、GPx(P<0.01)的活力，显著降低MDA(P<0.01)的含量。试验二，与42℃热应激组比较，15μM葛根素能够显著降低Bax/Bcl-2的基因和蛋白比值(P<0.01)，显著降低线粒体膜电位变化(P<0.05)，显著减少细胞色素C由线粒体向胞质的转移(P<0.05)，显著增高procaspase-3蛋白含量(P<0.05)、降低caspase-3基因(P<0.01)和caspase-3活性(P<0.01)，显著减少细胞凋亡率(P<0.01)。试验三，与34℃对照组比较，15μM葛根素显著增加了Hsp72基因和蛋白的表达(P<0.05)；同时，与42℃热应激组比较，15μM葛根素预处理细胞组，Hsp72基因和蛋白亦显著增加(P<0.01)。
　　本试验发现，添加15μM葛根素能够调节牛睾丸支持细胞在热应激过程中的抗氧化物酶SOD、CAT、GSH-PX的活力以及脂质过氧化物MDA的含量以减轻氧化损伤，并通过抑制线粒体凋亡通路减少细胞凋亡的发生，葛根素对热应激牛睾丸支持细胞的保护机制与其能够减少ROS生成和上调Hsp72表达有关。

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前言

1 热应激对机体的危害

2 氧化损伤

3 细胞凋亡

4 Hsp72

5 睾丸支持细胞于生殖能力的影响

6 葛根素的研究进展

7 研究目的与意义

试验一 葛根素对热应激bSCs细胞活力的影响

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

小结

试验二 葛根素对热应激bSCs的抗氧化、抗凋亡作用

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

小结

试验三 葛根素对bSCs的Hsp72表达的影响

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

小结

结论

参考文献

英文缩写词表

致谢

硕士期间取得的学术成果