山东省水貂出血性肺炎流行现状及病原学和耐药基因的研究

摘要

调查山东省水貂出血性肺炎的流行现状，研究貂源绿脓杆菌的病原学和耐药基因存在状况，旨在为该病的有效防控、治疗药品和疫苗的开发提供理论基础，降低水貂养殖经济损失。自2013-2015年，于省内各水貂养殖密集区358个疑似发病养殖场采集病料，调查发病情况；无菌环境中，采用鉴别培养基从病料中分离纯化病原菌；使用全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定和分离保存绿脓杆菌，并进行药敏分析；选用日本生研株式会社的绿脓杆菌血清学分型试剂盒将分离菌株分型；用昆明系小白鼠测定分离株的LD50，选择改良 Karber法计算结果，探究分离株的致病性；利用聚合酶链反应（PCR）检测耐药基因 SHV、TEM、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、DHA、oprD2、qacEΔ1-sul1、int I1。结果表明：
　　1．近三年，山东省水貂出血性肺炎的发病率为47.86％、死亡率31.25%、病死率65.29%，呈逐年上升的流行趋势。该病每年从6月中旬开始出现，8月达到发病最高峰，占全年发病数的61%左右，9月发病开始逐渐减少，至9月末10月初发病明显减少至不再发生，发病高峰期集中在7-9月；青岛红岛、潍坊诸城、威海文登、烟台海阳、临沂苍山、日照岚山和菏泽鄄城是该病的主要流行区域，潍坊、临沂、日照和菏泽地区发病数逐年升高，胶东半岛的青岛、烟台和威海逐年减少或与往年持平；60日龄前后水貂开始发病，120日龄左右是发病死亡的高峰阶段，公兽的死亡比率较母兽高20%，发病死亡的水貂中埋置褪黑激素的占95%以上。
　　2．绿脓杆菌对氨苄西林、氨苄青霉素-舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、复方新诺明和呋喃妥英耐药率100%，部分菌株对环丙沙星、左氧氟沙星耐药，耐药率由31.25%逐年升高至71.43%，所有分离株对头孢吡肟、头孢他啶、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、哌拉西林钠他唑巴坦、亚胺培南敏感，少数分离株对头孢他啶和庆大霉素中度敏感；46株分离绿脓杆菌中，B型17株（36.96%），G型13株（28.26%），I型6株（13.04%），E型4株（8.70%），C型3株（6.52%），分型率93.48%，G、E型菌呈逐年上升的流行趋势；两分离株1408015和H1508023绿脓杆菌对小鼠的 LD50分别为6.3×108 CFU/mL和1.45×108 CFU/mL，G型菌的致病性略强于B型，但没有很大的差别（＜5倍量）。
　　3．β-内酰胺酶编码基因TEM、DHA、PER、GES、VEB和IMP阳性菌株分别为14株（30.4%）、4株（8.7%）、3株（6.5%）、3株（6.5%）、2株（4.3%）和1株（2.2%），15株（32.6%）外膜通道蛋白oprD2基因缺失，Ⅰ类整合子int I1基因阳性8株（17.4%）， qacEΔ-sul1基因阳性6株(13.0%)，SHV、CARB和VIM基因均阴性。携带β-内酰胺酶编码基因TEM、DHA、PER、GES、VEB、IMP或外膜通道蛋白oprD2基因缺失的菌株共25株，占分离株的54.3%；携带Ⅰ类整合子遗传标志基因int I1或qacEΔ-sul1的菌株12株，占分离株的26.1%，其中4株同时携带3种β-内酰胺类耐药基因，3株同时携带2种β-内酰胺类耐药基因。
　　由此说明：
　　1.山东省水貂出血性肺炎的发病时间由8月提前至6月中旬，发病高峰由2个月延长至3个月；主要流行区域由沿海向内陆转移；120日龄左右埋置褪黑激素水貂是该病的易感兽群，公兽的死亡比率较母兽高20%。
　　2.绿脓杆菌对第三代、第四代半合成头孢菌素和氨基糖苷类抗菌素无耐药，对喹诺酮类耐药率由31.25%逐年升高至71.43%，对β-内酰胺类和磺胺类有天然耐药性。B、G型是引起山东省水貂发病的主要流行血清型，其菌株对小鼠的 LD50为别为6.3×108 CFU/mL和1.45×108 CFU/mL，都有较强的致病性。
　　3.分离菌株β-内酰胺类耐药与携带TEM、DHA、PER、GES、VEB、IMP基因和外膜通道蛋白oprD2基因缺失有关。Ⅰ类整合子对貂源绿脓杆菌耐药性的传播和多重耐药有关键作用，氧氟沙星和环丙沙星耐药率的逐年升高与其有关。

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前言

1 文献综述

1.1 水貂出血性肺炎概述

1.1.1 水貂出血性肺炎的临床症状

1.1.2 水貂出血性肺炎病原菌的实验室诊断方法

1.1.3 水貂出血性肺炎的发病机理

1.2 水貂出血性肺炎的流行病学研究进展

1.3 绿脓杆菌的病原学研究进展

1.3.1 绿脓杆菌的形态和培养特性

1.3.2 绿脓杆菌的生化特性

1.3.3 绿脓杆菌的致病性研究进展

1.3.4 绿脓杆菌的耐药性研究进展

1.3.5 绿脓杆菌的分型研究进展

1.4 绿脓杆菌耐药基因的研究进展

1.5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 病料

2.1.2 试验菌株

2.1.3 试验动物

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 主要试剂

2.2 试验方法

2.2.1 水貂出血性肺炎流行病调查

2.2.2 病原菌的抹片和涂片镜检

2.2.3 病原菌的分离培养和纯化

2.2.4 病原菌的生化鉴定和药敏试验

2.2.5 绿脓杆菌的保存

2.2.6 绿脓杆菌的血清学分型

2.2.7 绿脓杆菌的半数致死量（LD50）测定

2.2.8 绿脓杆菌核酸的提取

2.2.9 耐药基因引物的设计与合成

2.2.10 分子生物学验证

3 结果与分析

3.1 出血性肺炎流行现状调查结果

3.1.1 流行趋势

3.1.2 流行时间

3.1.3 流行地区

3.1.4 易感兽群

3.2 貂源绿脓杆菌的病原学研究结果

3.2.1 培养和革兰氏染色特性

3.2.2 生化鉴定结果

3.2.3 药敏试验结果

3.2.4 血清学分型结果

3.2.5 致病性测定结果

3.3 耐药基因研究结果

4 讨 论

4.1 水貂出血性肺炎的流行现状

4.2 貂源绿脓杆菌的病原学特征

4.3 耐药基因与分离株产生耐药性的关系

4.3.1 关于β-内酰胺类耐药

4.3.2 关于Ⅰ类整合子

5 结 论

参考文献

中英文缩略词表

致谢

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