猪2型圆环病毒全基因组的测序分析和感染克隆研究

摘要

猪2型圆环病毒（Porcine circovirus2，PCV2），是至今为止发现的最小的动物病毒之一。其主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，对规模化养殖场造成了不可估量的损失。由于其可引起免疫器官的病理变化，使猪自身的免疫系统受损，更加剧了其他病原菌的侵入，加重病情。现在越来越受到养殖者和科研工作者的关注。
　　本试验从山东省收集了多份PMWS疑似病料，并根据PCV2的Cap蛋白通过Prime5设计了一对特异性引物，用来检测。将阳性病料再经过磷钨酸染色，在透射电镜下观察。莱西的病料中观察到了17 nm左右的PCV2病毒粒子。并将病料接种到PK-15细胞中，用D-氨基葡萄糖处理，增加病毒的感染量。连续盲传6代，并用PCR来检测每代收获的病毒液。经检测，全为阳性。为接下来的试验提供了试验材料。
　　根据GenBank中己发表的PCV2全基因序列，设计一对特异性引物，用PCR方法直接从接毒细胞中扩增出PCV2的全基因组序列。将扩增片段克隆于pMD19-T载体进行测序，结果表明PCV2基因组全长为1767bp。应用DNAstar分析结果表明，在1479 bp-1468 bp处都含有特殊的TCA/AAC/CCC/CG(T)C序列，所以基因型为PCV2-1型。同时与选取的国内外23株已公布的序列进行系统进化树比较，确定其基因亚型为PCV2-1B，并命名为LX株。再选取山东地区的6株序列进行分析，核苷酸序列的同源性均超过96.9％，同源性较高，其3个ORF均出现了突变。ORF1和ORF3没有引起氨基酸的变化，而ORF2有2处氨基酸发生突变，128 R-W，179 S-F，而128位位于PCV2独特的抗原位点，推测影响PCV2的抗原性，进而影响毒力。
　　将pMD19-T-PCV2用SacⅡ单酶切，回收PCV2全基因。同时将目的载体pBLuescript KS载体用SacⅡ单酶切回收，并用去磷酸化酶CIAP处理，防止载体自连。将PCV2-1B与pBluescript KS连接，获得了两个重组克隆载体，分别命名为pBluescript KS-PCV2（+）和pBluescript KS-PCV2（-）。将2个载体转染PK-15细胞，通过RT-PCR检测，结果表明构建的PCV2克隆具有感染性，但是pBluescript KS-PCV2（+）的感染性较强。
　　本研究成功克隆出PCV2的全基因，并构建了两个感染性克隆，为PCV2的致病机理和新型疫苗的研制提供了技术和理论依据。

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第一部分 文献综述

1 PCV 2基本结构与特性

2 流行病学

3 PCV 2相关的疾病

4 PCV 2检测方法

5 研究目的和意义

第二部分 试验研究

试验一 猪2型圆环病毒的分离鉴定

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

4本章小结

试验二 猪2型圆环病毒全基因组的测序分析

1 材料与方法

2 结果

3讨论

4 本章小结

试验三 感染性克隆的构建

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 本章小结

全文结论

参考文献

英文缩略词表

导师组意见

致谢

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