半胱氨酸蛋白酶IdeS的原核表达、纯化、活性鉴定及应用

摘要

抗体及相关的产品的出现标志着在制药领域中一种快速发展的新兴药物的到来。在癌症和自身免疫病治疗方面,抗体类药物的重要性日益突出且日渐成为焦点。因此,为了保证药品质量及开发新药,对于抗体类大分子的特性及表征分析也显得格外重要。其中特异性水解大分子抗体对研究抗体的结构及功能有着非常重要的意义。酿脓链球菌来源的免疫球蛋白 G降解酶(Immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes, IdeS)是一种典型的半胱氨酸水解酶,可以在抗体的铰链区的特定位点进行酶切,使IgG水解为完整的(Fab)2片段和Fc片段,因此可以更直观、更快捷的提高抗体结构的分辨能力并进行更精细的特征性分析。
　　IdeS独特的底物选择性,使它成为抗体类药物表征分析的重要工具酶。相关研究报道表明,IdeS的酶切特异性要远高于其他相关的蛋白酶,如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、Lys-C等,可以避免酶切后产生非特异性小碎片而导致分析困难。此外,IdeS还是一种高性能的蛋白酶,其稳定的酶学活性也扩大了它的使用范围。所以,IdeS是目前为止最适用的抗体类蛋白分析工具酶之一,但是该酶使用量大,目前关于该酶的提取或制备仍不够高效,严重限制了该酶的应用,新的重组表达策略成为目前研究的热点。
　　然而目前为止,国内尚无关于 IdeS高效制备及特性研究的报道。因此,为了高效重组表达IdeS并验证重组IdeS酶的特异性及活性,本论文利用全基因合成方法获得蛋白酶 IdeS活性区部分的核苷酸序列并利用 PCR技术在目的蛋白的羧基端加上His6标签,以利于酶与抗体反应结束后通过纯化除去该酶。本文通过融合 GST的方式,使用原核表达载体pGEX-4T-2可溶性高效表达出一种全新的重组蛋白酶IdeS,经过GST亲和层析可以进一步高效纯化,并在GST融合标签和蛋白酶之间加入肠激酶酶切位点,可以方便地进行标签的去除。纯化出的高纯度IdeS酶通过SDS-PAGE、HPLC-SEC和LC-MS进行了分析和鉴定,结果表明:重组蛋白酶IdeS的表达量高、特异性好、纯度高,且在不同缓冲液中均具有较强的稳定性,能够满足蛋白质结构分析对蛋白酶的高质量要求,活性研究表明,IdeS发挥高活性的PH范围是5.1~8.0,最适PH是6.6,反应温度在37℃左右。
　　最后,我们通过了一个特殊的抗体案例,其除了固定的Fc段N-糖基化修饰外,(Fab)2片段上也会有 N-糖修饰或者 O-糖修饰,这可能会在人体引起免疫原性反应。而且,糖基化还会影响抗体与初生Fcγ受体(FcγR)的结合,进而影响抗体在血浆中的半衰期。我们通过该重组酶对该抗体进行了很好的质谱鉴定,为以后抗体药物的质控及检定提供了很好的范例,对抗体研发来说意义显著,而且也可以应用于生物仿制药、生物改良药和新一代抗体以及Fc-融合蛋白的研究。

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前言

第一章 绪论

1.1 IdeS的简介

1.2 IdeS 结构特征

1.3 IdeS 的底物特异性

1.4 IgG及IdeS相互作用机理

1.5 IdeS酶学性质的研究

1.6 经典的原核表达系统

1.7 肠激酶的使用优势

1.8 亲和纯化系统的建立及应用

1.9 HPLC-SEC及LC/MS技术的分析检测

1.10 IdeS研究现状及思路

第二章 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

第三章 结果与分析

3.1 pET32a(+)/IdeS的构建

3.2 pGEX4T2/IdeS的构建

3.3 pET32a(+)/IdeS/BL21的诱导表达

3.4 pGEX4T2/IdeS/BL21的诱导表达

3.5 pGEX4T2/IdeS/BL21重组蛋白纯化

3.6 HPLC-SEC检测蛋白IdeS的酶活

3.7 蛋白酶IdeS适用于不同缓冲液分析

3.8 蛋白酶IdeS在抗体类药物质谱分析中的应用

第四章 结论与展望

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文