利用大肠杆菌和烟草表达的重组全人源药用抗EGFR单链抗体的抗肿瘤分析

摘要

表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）是肿瘤治疗中一个很重要的靶分子，针对EGFR靶点的抗体药物的研究具有广阔的前景。scFv是一种小分子抗体片段，其免疫原性较小，已逐渐成为抗体靶向治疗的重要研究方向。目前，虽然动物细胞表达抗体时，抗体活性高，但生产成本高。原核生物反应器可以有效的解决生产成本高的缺陷，但是其仍存在不足之处，它不能对翻译后的蛋白进行修饰，因而只适合表达 Fv，scFv、Fab等抗体。植物生物反应器可以解决以上两者的缺陷，被认为是一种生产成本低、蛋白活性高的生物反应器。如已经有多种Fab、scFv等都已在植物中成功地表达。抗体经历了鼠源抗体，人源化抗体和全人源抗体三个阶段，全人源scFv能很大程度的消减HAMA反应。乳腺癌是常见的恶性肿瘤。抗EGFR单克隆抗体具有抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用。
　　本试验采用生物信息方法对HLL和LLH基因序列进行构建，并预测这两种蛋白的性质。构建了pET-28a-c(+)-HLL、pET-28a-c(+)-LLH表达载体；利用E.coli生产HLL-pET和LLH-pET蛋白，并分析其抗肿瘤活性。构建了pBI121-HLL-YC表达载体；利用烟草生产HLL-YC蛋白，并对其进行了Western Blotting检测。为了提高目的蛋白在烟草中的表达量和生物活性，构建了HLL-YCPH-YC和LLH-YCPH-YC基因序列。研究结果如下：
　　1.HLL、LLH的生化指标都与可溶性scFv相符，但只有HLL与可溶性scFv有相似的空间结构。
　　2.构建了pET-28a-c(+)-HLL、pET-28a-c(+)-LLH表达载体，表达了HLL-pET和LLH-pET蛋白。HLL-pET对MCF-7有显著的增殖抑制作用，具有生物活性。LLH-pET对MCF-7无显著的增殖抑制作用，不具有生物活性。
　　3.构建了pBI121-HLL-YC表达载体，表达了HLL-YC蛋白。
　　4.构建了HLL-YCPH-YC和LLH-YCPH-YC抗体基因序列，为了提高目的蛋白在烟草中的表达量和生物活性奠定了基础。

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前言

第一章 文献综述

1.1 癌症

1.2 EGFR

1.3 肿瘤抗体的研究进展

1.4 全人源化抗肿瘤抗体的表达系统

1.5 单链抗体

第二章 重组全人源药用抗EGFR scFv(HLL)和重组全人源药用抗EGFR scFv(LLH)基因设计及其生物信息学分析

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果

2.5 讨论

第三章 重组全人源药用抗EGFR scFv(HLL-pET)和重组全人源药用抗EGFR scFv(LLH-pET)的构建、E.coli表达及抗肿瘤活性分析

3.1 引言

3.2 实验材料与仪器

3.3 试验方法

3.4 结果

3.5 讨论

第四章 重组全人源药用抗EGFR scFv(HLL-YC)的构建、烟草表达及蛋白鉴定

4.1 引言

4.2 实验材料与仪器

4.3 试验方法

4.4 结果

4.5 讨论

第五章 重组全人源药用植物偏好性密码子抗EGFR

列分析

5.1 引言

5.2 HLL-YCPH序列分析

5.3 构建LLH-YCPH-YC序列

5.4 讨论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文