蚯蚓组织中新型DNA酶样物质分离纯化工艺研究及蛋白质组技术方法应用

摘要

该课题运用蛋白质色谱纯化技术对蚯蚓组织中的新型DNA酶样物质进行了系统、全面的色谱柱上色谱行为分离纯化研究;并通过应用最新现代生物信息学、蛋白质组技术体系对此酶的部分信息结构进行了鉴定.一.蚯蚓组织中新型DNA酶样物质色谱柱上色谱行为分离纯化研究 利用Kunitz、Yasuda等对DNAse I的酶活力定义作为新型DNA酶样物质的活性检测体系;通过对此酶特殊的理化特性研究,首先经过糖溶法、选择性酸变性、热冲击变性、乙醇沉淀等物理方法完成高效粗分级分离制备,去除了大部分杂蛋白,实现从复杂的样品体系中大量、快速的捕获目标蛋白;然后利用AmershamBiosciences公司的AKTApurifier层析仪、选用SepharoseFastFlow和Sephacryl系列凝胶以及HitrapSelectionKit和XK系列层析柱研究蚯蚓组织中新型DNA酶的色谱行为与分离特性. 二.蚯蚓组织新型DNA酶样物质快速、精确的蛋白质组技术方法应用 从SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上切下分离得到的目的蛋白条带进行胰蛋白酶胶内酶解,经过脱色、肽提取、Matrix混合然后经MALDI-TOF-MS获得酶解后肽片段的肽质量指纹图谱(PMF)及一组肽分子量数据信息,利用MASCOT通过SWISS-PROT数据库检索对目的蛋白进行鉴定,通过MOWSE评分方法在未能得到准确匹配识别的前提下进一步利用纳升电喷雾串联质谱(MS/MS)进行自动数据依赖性扫描,选定母离子经碰撞诱导裂解(CID)产生串联质谱谱图,与NCBI数据库中肽序列的理论串联质谱谱图进行对比检索鉴定蛋白质,同时对母肽进行原始MS/MS谱图的解释确定获得重新测序(denovopeptidesequencing).该课题通过对蚯蚓组织中新型DNA酶样物质多重色谱技术研究成功的探索出一条高效快速稳定的下游精纯化工艺;同时利用蛋白质组生物质谱技术对分离纯化样品成功地进行了生物学鉴定,为下游纯化研究提供了一个坚实可靠的蛋白质生物信息学技术理论平台.

目录

前言

第一部分蚯蚓组织新型DNA酶精制纯化色谱研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二部分蚯蚓组织新型DNA酶蛋白质组技术方法应用

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

参考文献

综述

参考文献

附图

致谢