pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白的高效表达、分离纯化及其鉴定

摘要

目的: 人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染是引起宫颈癌的主要病因，高危型HPV16是主要的感染类型。而HPV并非宫颈癌发生发展的唯一因素，单纯疱疹病毒(Herpessimplex virus，HSV)可能作为协同因子在宫颈癌变发生发展的过程中起重要作用。用PCR法从HPV中扩增出L1基因片段及从HSV中扩增出gD基因片段作为目的基因，并将目的基因插入到pBV220原核表达载体中；为了获得pBV220-HPVL1和pBV220一HSVgD重组蛋白，故将上述重组载体在E.coli DH5α中进行诱导表达、蛋白纯化及其鉴定，以期为研制宫颈癌预防性疫苗奠定基础。 方法: 重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转化E.coil DH5a，温控诱导，以包涵体形式获高效表达。在超声液中加入终浓度为2mol/L的尿素分离洗涤包涵体，然后将其溶于8mol/L尿素中，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。将一定量的目的蛋白与免疫佐剂混合后免疫家兔。免疫方式采用皮下多点注射，经7次免疫后，取兔耳缘静脉血行双向琼脂免疫扩散法检测抗体滴度，滴度合适后，进行心脏采血。采集分离的血清进行双向琼脂免疫扩散，此外，用Western-blot检测和鉴定pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD目的蛋白。 结果: 1、将重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转入大肠杆菌DH5α，分别经42℃诱导表达6小时和5小时，成功表达了相应的pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白。SDS-PAGE分析表明：两者均以包涵体形式存在，pBV220-HPVL1重组蛋白的分子量约为64KD，pBV220-HSVgD重组蛋白的分子量约为13KD。 2、将包涵体超声裂解、分离沈涤后，获得了较纯的目的蛋白，经8M尿素处理后，紫外吸收法测定HPVL1与HSVgD蛋白浓度分别为5.9mg/ml与4.6mg/ml。 3、以pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白分别免疫家兔，制备了抗HPVL1、HSVgD多克隆抗体，以重组蛋白为抗原，用双向琼脂免疫扩散法检测HPVL1、HSVgD抗血清的效价均达到1:16，且HPVL1、HSVgD抗体与免疫原之间形成单一沉淀线，表明所制备的多抗具有良好的纯度。 4、免疫印迹分析HPVL1抗血清在分子量约64KD，HSVgD抗血清在分子量约13KD处与相应的原核表达蛋白呈现特异性结合条带，表明所表达的蛋白均为目的蛋白。 结论: 应用基因工程技术，将重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转入大肠杆菌DH5a，成功地高效表达了pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白。经免疫家兔获得的抗HPVL1和抗HSVgD两种多克隆抗体都具有良好的特异性和较高的抗体效价，为进一步动物实验的研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

实验一pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD的高效表达及其产物的制备

1.1材料

1.2方法

1.3结果

1.4讨论

小结

实验二HPVL1和HSVgD重组蛋白多克隆抗体的制备

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

小结

实验三目的蛋白的鉴定

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4讨论

小结

参考文献

综述 HPV、HSV与宫颈癌的发生及其预防性疫苗的研究进展

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