Toll样受体3与HBV感染和HBV宫内感染的关系及其作用机制的研究

摘要

目的:为研究人PBMCTLR3在人HBV感染和HBV宫内感染中的作用，本课题采用人群研究和体外实验相结合的方法，从基因和蛋白水平初步了解正常孕妇人群与HBsAg阳性孕妇人群PBMCTLR3的表达情况以及与HBV感染和HBV宫内感染的关系，根据人群研究的线索进一步进行体外实验，探索TLR3在抗HBV感染中的作用机制。 方法: 1.人群研究 ①以2004年7月至2006年1月由太原市传染病院妇产科进行产前检查并分娩的HBsAg阳性孕妇为研究队列，从产前检查追踪观察至分娩，共收集HBsAg阳性孕妇及其新生儿228对。采集孕妇分娩前肘静脉血和新生儿出生24小时内注射乙肝疫苗前的股静脉血，同时收集其流行病学资料，佣免疫荧光双标记的方法检测HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC涂片上HBsAg的表达及TLR3的分布；用巢式病例对照研究的方法进行TLR3与PBMCHBV感染，TLR3与PBMCHBV宫内感染的研究。以PBMCHBV感染者为病例组，非感染者为对照组，分析HBsAg阳性孕妇及新生儿PBMCTLR3表达与PBMCHBV感染的关系; ②于2006年11月至2007年4月，从太原市传染病院妇产科选取外周血HBsAg阳性的足月分娩孕产妇及其新生儿共28对，同期从山西省妇幼保健院妇产科收集正常足月分娩孕产妇26例作为正常孕妇对照，采集孕妇肘静脉血和新生儿出生后24小时内注射乙肝疫苗前的股静脉血，用荧光定量PCR定量检测HBsAg阳性孕妇及其新生儿血清HBVDNA，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝标志物，用RT-PCR方法检测正常孕妇和HBsAg阳性孕妇PBMCTLR3mRNA，分析PBMCTLR3mRNA与HBV感染的关系；用real-timeRT-PCR方法检测HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMCTLR3mRNA，分析PBMCTLR3mRNA与HBV感染及HBV宫内感染的关系；ELISA方法分别检测HBsAg阳性孕妇和正常孕妇血清中IL-2、6的浓度，分析HBV感染与细胞因子的关系及TLR3与细胞因子分泌的关系。 2.体外实验 ①于2007年4月至2007年10月从山西医科大学第一医院妇产科收集正常足月分娩孕产妇26例，收集其肘静脉及流行病学资料。分离外周血PBMC，用含10％胎牛血清的1640培养液进行原代细胞培养，设HBV刺激组和正常对照组，在培养2、4、6天后分别收集PBMC细胞和培养上清，real-timeRT-PCR方法检测PBMC的TLR3mRNA，FACs方法检测PBMC的TLR3蛋白，ELISA方法检测培养上清液IL-2、6、10、12、IFN-℃和TNF-α的浓度； ②用RNAi技术沉默正常献血者PBMCTLR3mRNA，用TLR3的配体PolyI:C刺激活化TLR3，并在相应处理后与一定量的HBV共孵育6天，在2，4，6天分别收集PBMC细胞和培养上清，real-timeRT-PCR检测TLR3mRNA，FACs检测TLR3蛋白，荧光定量PCR定量检测培养上清和PBMC中HBVDNA含量。 3.统计分析资料查实后输入数据库，采用SPSS13.0forwindows软件进行统计分析，计数资料采用X2分析，计算各指标阳性率、X2值、OR值及其95％可信区间；计量资料采用t检验、配对t检验、方差分析及相关性分析。 结果: 1.HBsAg阳性孕妇PBMCTLR3蛋白和PBMCHBV感染的关系 ①HBsAg分布在PBMC胞膜和胞浆部位；TLR3分布在胞膜上，TLR3在不同PBMC涂片中表达强度不同，同一视野下不同的细胞表达强度也不同，且在TLR3表达强的细胞上HBsAg表达弱。 ②228例HBsAg阳性孕妇有64例(28.07％)PBMCHBsAg阳性；161例(70.61％)TLR3强表达；TLR3在PBMCHBV感染组和非感染组的表达差异有统计学意义(X2=30.944，P＜0.0001)；新生儿有35例(15.35％)PBMCHBsAg阳性；HBsAg阳性孕妇PBMCTLR3的表达与新生儿PBMCHBV宫内感染有关(X2=12.354，P＜0.0001)。TLR3可能是HBsAg阳性孕妇PBMCHBV感染的保护因素(OR=0.181，95％CI=0.091-0.340)，也是PBMCHBV宫内感染的保护因素(OR=0.279，95％CI=0.133-0.585)。 2.人群PBMCTLR3mRNA与HBV感染的关系 ①用RT-PCR检测HBsAg阳性孕妇组和正常孕妇组PBMCTLR3mRNA，HBsAg阳性孕妇组TLR3mRNA的相对表达量(0.8164±0.1608)高于正常孕妇组(0.3892±0.1879)，其差异有统计学意义(t=-8.997，P＜0.001)。 ②用real-timeRT-PCR检测正常孕妇、HBsAg孕妇及其新生儿PBMCTLR3mRNA，HBsAg阳性孕妇组TLR3mRNA的相对表达量高于正常孕妇组(t=9.14，P＜0.0001)。在HBsAg阳性孕妇组中又分为DNA阴性组，≤104copies/ml组和＞104copies/ml组，TLR3mRNA在这三组中差别无统计学意义(F=0.468，P＞0.05)；且在HBsAg阳性孕妇组中的大三阳组和非大三阳组TLR3mRNA差别无统计学意义(t=0.355，P=0.725)；在HBsAg阳性孕妇组中的HBV宫内感染组和非HBV宫内感染组，TLR3mRNA差别无统计学意义(t=-1.525，P=0.139)。 ③根据新生儿血清中乙肝标志物的检测结果将新生儿分为HBV宫内感染组和非HBV宫内感染组，新生儿HBV宫内感染组TLR3mRNA高于非HBV宫内感染组，差别有统计学意义(t=2.613，P=0.015)。 3.人群TLR3mRNA与IL-2、6分泌的关系 ①DHBsAg阳性孕妇血清中IL-2的浓度(32.95±9.93pg/ml)比正常孕妇(27.65±2.86pg/ml)高，而IL-6浓度(52.35±22.09pg/ml)较正常孕妇(544.6±615.4pg/ml)低，差别均有统计学意义(t=-2.291，P=0.028；t=3.575，P=0.002)，并且以IL-2代表Th1型细胞因子，IL-6代表Th2型细胞因子计算Th1/Th2比值，HBsAg阳性孕妇组Th1/Th2(0.22±0.25)比正常孕妇组(0.71±0.27)小，差别具有统计学意义(t=-5.86，P＜0.05)。 ②HBsAg阳性孕妇的HBV宫内感染组血清中IL-6浓度(81.00±21.64pg/ml)高于非HBV宫内感染组(42.80±11.7pg/ml)，差别具有统计学意义(t=-3.77，P=0.014)。Th1/Th2比值(0.43±0.13)低于非HBV宫内未感染组(0.80±0.24)，差别具有统计学意义(t=3.334，P=0.004)。 ③以TLR3/β-actinCt值与相应标本的IL-2，6的浓度作相关分析，得出TLR3/β-actinCt值与IL-2的浓度呈负相关关系，r=-0.56，P＜0.05，随着TLR3的增加，IL-2分泌增加。而未发现与IL-6有相关性，r=0.096，P＞0.05。 4.HBV体外刺激正常孕妇PBMCTLR3的表达及与细胞因子分泌的关系 5.RNAi沉默TLR3和PolyI:C活化TLR3后对HBV感染的影响 结论: 1.TLR3在PBMC有表达，在PBMC不同细胞上表达强度不同。在TLR3表达强的细胞上HBsAg表达弱或无表达。 2.TLR3与HBV感染有关，HBV阳性的PBMCTLR3低表达，TLR3是PBMCHBV感染的保护因素；以新生儿PBMCHBV感染判为新生儿PBMCHBV宫内感染，母亲TLR3蛋白是新生儿PBMCHBV宫内感染的保护因素。以新生儿血清HBV标志物HBsAg，HBVDNA任一阳性定义新生儿HBV宫内感染，母亲PBMCTLR3表达与新生儿HBV宫内感染无统计学关联，但新生儿PBMCTLR3表达是新生儿HBV宫内感染的保护因素。 3.TLR3与Th1细胞因子的分泌呈正相关关系，TLR3可能通过增加细胞因子的分泌参与HBV的清除过程。 4.以HBV刺激正常孕妇PBMC可使PBMCTLR3mRNA和TLR3蛋白表达上调，IL-10，IL-6，IFN-γ随着TLR3的上调而分泌增加，而TNF-α，IL-2分泌增加显著，说明HBV感染PBMC以启动Th1型免疫反应为主。 5.RNAi后TLR3在蛋白水平和基因水平上有所降低，一定程度上增加了PBMC对HBV的易感染性。PolyI:C刺激后TLR3在蛋白水平和基因水平上有所升高，并一定程度上降低了PBMC对HBV的易感染性。TLR3可一定程度上影响HBV的复制增值。 6.可以考虑将TLR3作为乙型肝炎治疗性疫苗或佐剂及辅助性治疗药物的作用靶点来开发应用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：常用缩写词中英文对照表

声明

前言

第一部分Toll样受体3与HBV感染及宫内感染关系的人群研究

第一章TLR3与HBV感染的关系

一、PBMC TLR3蛋白表达与PBMC HBV感染的关系

二、TLR3 mRNA与孕妇血清HBV感染的关系

三、TLR3 mRNA与孕妇HBV感染及新生儿HBV宫内感染的关系

第二章IL-2、6与HBV感染及TLR3表达的关系

1对象与方法

2结果

3讨论

第二部分Toll样受体3在HBV感染中作用的体外研究

第一章PBMC的分离培养及Toll样受体3表达的检测

1材料与方法

2结果

3讨论

第二章Toll样受体3与PBMC细胞因子分泌关系的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

第三章Toll样受体3的RNA干扰和活化

1材料与方法

2结果

3讨论

第四章Toll样受体3与HBV病毒复制的关系

1材料与方法

2结果

3讨论

全文小结

本文研究特色

参考文献

综述 HBV感染与免疫的关系研究进展

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致谢