蛋白酶体抑制剂MG-132对大鼠骨骼肌成肌调节因子MyoD基因表达的影响

摘要

目的：探讨蛋白酶体抑制剂MG-132对大鼠骨骼肌成肌调节因子(MyoD)基因表达的影响。 方法：选择健康的雄性SD大鼠72只，体重195±5g，随机分成3组，即A组：空白对照组、B组：去神经组、C组：去神经MG-132干预组，每组24只。A组不做处理；B组和C组全部制作成标准的右侧坐骨神经离断，腓肠肌失神经支配模型，并在C组大鼠失神经腓肠肌局部多点注射浓度为20μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG-132100μL，1次/d。分别于去神经第2d、7d、14d、28d，用脊椎脱臼法处死大鼠，解剖并分离出右小腿的腓肠肌，切取的肌肉样本快速置于-70℃冰箱冻存，留待28天后统一检测。用逆转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)检测MyoD mRNA的表达变化，以GAPDH作为内参照，做半定量检测。取样本组织50mg匀浆后用抽提试剂进行总RNA抽提，然后用MBI公司的RT-PCR试剂盒，按样本RNA2μg，20μl体系进行反转录。MyoD的引物通过primer5.0引物设计软件设计，片断长度为137bp；作为内参照的GAPDH的引物由山西医科大学实验中心提供，片断长度为307bp。聚合酶链反应按50μl体系，反应条件为：94℃，2′，lcycle。94℃，30″；Tm(MyoD53℃)/(GAPDH50℃)，30″；72℃，2′，36 cycle。用琼脂糖凝胶水平电泳，电压采用160v，电泳约1h，然后用凝胶成像仪获取图像。用免疫印迹法(Westernblot法)测定MyoD的蛋白质表达的变化：用β-actin作为内参照，做半定量检测。取样本组织100mg匀浆后用普利莱蛋白提取试剂盒进行总蛋白抽提，煮沸、离心后，加样于垂直电泳槽行SDS-PAGE，电泳约3小时，转膜1小时30分钟，封闭室温4小时，孵育一抗(Ab1)4℃过夜，漂沈后孵育二抗(Ab2)4℃约4小时，TBS漂洗后，置于暗室加ECL发光试剂盒反应，一分钟左右立即放在暗箱曝光，60秒左右取出浸入显影剂内，观察至最佳显影后，捞出在清水中洗净，然后置于定影剂中15分钟，取出晾干后用数码相机获取图片。最后用Photoshop图像软件获取数据，用SPSS13.0软件进行统计分析。 结果：(1)B组和C组MyoD的mRNA和蛋白含量在去神经支配后第2d、7d、14d、28d均表达上调与A组比较有统计学差异(P＜0.05)；(2)B组与C组的MyoDmRNA和蛋白含量在去神经支配后第2d、7d、14d、28d的比较有统计学差异(P＜0.05)；(3)大鼠骨骼肌失神经支配早期，失神经的时间和失神经后的干预因素相互作用，影响去神经骨骼肌Myod mRNA和蛋白含量的表达。 结论：(1)在SD大鼠腓肠肌去神经早期，Myod mRNA和蛋白质的表达是上调的；(2)在失神经骨骼肌中，Myod mRNA和蛋白质的表达受到时间和干预方法二因素的交互影响；(3)蛋白酶体抑制剂MG-132可以通过抑制泛素-蛋白酶体途径，上调MyoD因子的表达，进一步影响肌萎缩后的肌再生过程，这可能也是其延缓骨骼肌萎缩的作用机理之一。

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结论

参考文献

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综述：泛素-蛋白酶体途径的研究进展

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