[Gly]-Humanin拮抗淀粉样β-蛋白神经毒作用及其机制的电生理和胞内钙成像研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)即老年性痴呆，是一种以进行性学习记忆和认知功能障碍为特征的中枢神经系统退行性疾病。AD的典型病理特征之一是脑内出现高密度的老年斑，其主要成分是由39～43个氨基酸组成的淀粉样β—蛋白(amyloidβ-Protein，Aβ)。目前，有关Aβ的神经毒性作用，无论是离体还是在体实验，都已有广泛报道。然而，Aβ发挥神经毒性作用的细胞和分子机制很复杂，迄今为止还不十分清楚，也还缺乏有效的针对Aβ的抗AD药物。 海马长时程增强(long—term potentiation，LTP)是突触传递可塑性的一种表现形式，其损伤与动物认知缺陷高度相关，故海马LTP已被广泛作为研究学习和记忆的电生理细胞模型。有报道表明，AD患者的认知功能下降与中枢突触可塑性如海马LTP受到损伤有关。本研究先前的实验也证实，Aβ能够伤害大鼠在体或离体的海马LTP。参与海马LTP诱导的一个重要的受体是N—甲基-d—天冬氨酸(N—methyl-d—aspartate，NMDA)受体，γ—氨基丁酸(gamma—aminobutyri cacid，GABA)受体也发挥重要的调制海马LTP的功能。研究表明，在Aβ伤害海马LTP的神经毒性作用中，NMDA和GABAA受体很可能是Aβ的有效靶点。Aβ及其有效活性片段可能通过影响NMDA和GABAA受体的功能影响突触可塑性和海马LTP，从而影响认知功能。同时，大量研究已经证明，Ca2+作为一种第二信使在调节细胞反应、影响神经系统的发育和突触可塑性活动中起关键作用；Aβ诱导的钙内流可能是Aβ引起的众多事件中较早发生的事件，胞内钙稳态的紊乱是Aβ发挥神经毒性作用的重要机制之一。因此，积极寻找拮抗Aβ神经毒性、保护NMDA受体、GABA受体及细胞内Ca2+稳态免受Aβ伤害的措施或药物，成为治疗和预防AD的一个关键问题。 Humanin(HN)及其强效衍生物[Gly14]—Humanin(HNG)的发现为AD和其它记忆损伤疾病的治疗开辟了一条新的道路。HN可有效保护神经元免于多种AD相关损伤引起的细胞死亡，如神经毒性Aβ蛋白。并且，在已报道的抗Aβ神经毒性的神经保护因子中，HN是唯一一种既能抑制Aβ神经毒、又能抑制各种家族性AD基因突变和APP抗体诱发的神经毒性作用的短肽。HNG能够逆转Aβ蛋白诱导的实验动物的记忆损伤，这提示HN是一个很有希望的治疗AD的候选药。然而，直到目前为止，HN的神经保护作用仍缺乏在体和离体的电生理证据，HN是否能够拮抗Aβ造成的LTP及LTP相关离子通道或受体的损伤，以及HN神经保护作用的分子机制仍然不很清楚。 因此，本研究进行了如下三部分工作：(1)利用场电位记录手段，检测了脑室注射HNG对不同Aβ片段抑制在体大鼠海马CA1区LTP的作用，并通过酪氨酸激酶抑制剂Genistein的使用，探讨了HNG发挥神经保护作用的酪氨酸激酶机制；(2)采用全细胞膜片钳技术研究了不同Aβ片段对LTP相关的配体门控通道即NMDA和GABA受体的效应，并进一步观察了HNG是否能对此效应发挥调制或保护作用；(3)使用荧光Ca2+成像技术观察了HNG是否对不同Aβ片段引起的[Ca2+]i升高具有保护作用，并探讨是否有酪氨酸激酶机制参与。在以上工作中，通过使用和比较不同Aβ片段，观察其影响场电位、NMDA受体和GABA受体的效应，也将为我们先前提出的假说即Aβ31-35可能是全长Aβ分子发挥神经毒性作用的更短的活性中心提供进一步的证据。 第一部分：[Gly14]—Humanin保护大鼠在体海马CA1区LTP免受淀粉样β—蛋白的伤害。 为研究神经保护肽HNG对不同Aβ片段损伤在体大鼠海马CA1区LTP的保护作用及其可能的酪氨酸激酶机制，本实验将麻醉大鼠固定在立体定位仪上，通过给予海马Schaffer侧支单个电刺激、强直电刺激或双脉冲刺激，在海马CA1区诱发和记录基础的场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potentials，fEPSPs)、强直刺激引起的fEPSPs的长时程增强即LTP以及配对脉冲引起的双脉冲易化(paired pulse facilitation，PPF)。经脑室套管向侧脑室内注射各种Aβ片段、HNG及特异性酪氨酸激酶抑制剂Genistein后，观察了各种药物对基础fEPSPs、LTP以及PPF的影响。 以上结果显示，Aβ31-35和Aβ25-35具有相似的压抑海马LTP效应，提示Aβ31-35可能是Aβ更短的活性中心；HNG能够剂量依赖性地保护海马LTP免受Aβ引起的损伤，并且酪氨酸激酶通路可能参与了HNG的保护作用，提示应用HNG以及增强酪氨酸激酶活性可能成为治疗AD的有效方法或途径。 第二部分：[Gly14]—Humanin逆转了淀粉样β—蛋白对原代培养大鼠皮层神经元NMDA和GABA受体电流的效应。 兴奋性和抑制性突触活动的适度调节是大脑发挥正常生理功能的前提，兴奋性和抑制性受体/通道在突触传递过程特别是突触可塑性中起着关键作用。本实验在第一部分LTP实验发现的基础上，利用全细胞膜片钳技术，记录了原代培养的大鼠皮层神经元NMDA和GABAA受体介导的全细胞电流。通过重力灌流系统急性给予不同的Aβ片段、HNG及特异性酪氨酸激酶抑制剂Genistein，观察了不同的Aβ片段对神经元兴奋性和抑制性受体电流的效应，研究了神经保护肽HNG是否能对此效应产生调制作用及其可能的酪氨酸激酶机制。 以上结果表明：急性给予Aβ25-35和Aβ31-35均可对原代培养的大鼠皮层神经元NMDA和GABA受体产生调制作用。这些结果可能有助于解释Aβ诱导的海马LTP的损害，其中突触内NMDA受体的下调可能会直接影响LTP的诱导；GABA受体的下调有可能破坏神经系统兴奋和抑制的平衡，增加细胞的兴奋毒作用。该结果为Aβ损伤谷氨酸能和GABA能系统以及HNG对抗Aβ神经毒性作用的保护效应提供了进一步的电生理证据。 第三部分：[Gly14]—Humanin对淀粉样β—蛋白引起的原代培养大鼠皮层神经元细胞内钙水平的影响 本实验使用激光扫描共聚焦显微镜成像系统进行细胞内Ca2+荧光成像实验，观察了各种Aβ片段对原代培养的大鼠皮层神经元细胞内Ca2+浓度(intracellular calciumconcentration，[Ca2+]i)的影响，并研究了HNG对Aβ诱导的钙稳态紊乱的保护作用及可能的酪氨酸激酶机制。 钙成像实验结果表明： (1)Aβ25-35和Aβ31-35均可使原代培养的大鼠皮层神经元[Ca2+]i升高，提示Aβ的神经毒性与Aβ引起的细胞内钙超载有关； (2)HNG剂量依赖地抑制了Aβ25-35和Aβ31-35诱导的[Ca2+]i升高，提示HNG对原代培养的大鼠皮层神经元具有保护作用，其机制至少部分是通过减弱Aβ引起的细胞内钙超载实现的； (3)特异性酪氨酸激酶抑制剂Genistein去除了HNG对Aβ25-35或Aβ31-35引起的[Ca2+]i升高的抑制作用，提示某些酪氨酸激酶参与了HNG对Aβ诱导的[Ca2+]i升高的保护作用； (4)Aβ25-35和Aβ31-35引起[Ca2+]i升高的效应在许多实验组中都非常相似，包括Aβ片段单独使用和Aβ与HNG、Genistein联合使用，这支持本研究之前提出的假设：Aβ31-35是全长Aβ分子中一个更短的片段，可能是Aβ分子发挥神经毒性作用的活性中心。 总之，本研究利用电生理技术即细胞外场电位记录和全细胞膜片钳记录手段，结合激光扫描共聚焦显微镜Ca2+荧光成像技术，通过记录大鼠在体海马LTP、引导原代培养的皮层神经元NMDA受体和GABA受体电流以及测定神经元细胞内钙离子水平的变化，探讨了神经保护肽HNG对Aβ神经毒性作用的调制以及可能的酪氨酸激酶机制。研究结果首次表明，HNG能够保护神经毒性Aβ诱导的在体海马LTP损伤、逆转Aβ对LTP相关受体(NMDA和GABA受体)电流的损害、并且抑制了Aβ引起的[Ca2+]i升高。 本研究进一步的结果还提示，酪氨酸激酶通路可能参与了HNG的神经保护作用。因此，本研究为HN的神经保护作用及其机制提供了强有力的电生理和细胞内钙成像证据，为HNG有可能成为AD治疗措施之一提供了研究基础。

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声明

Part Ⅰ : [Gly14]-Humanin Rescues Long-Term Potentiation from Amyloid β Protein-Induced Impairment in the Rat Hippocampal CA1 Region In Vivo

ABSTRACT

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

REFERENCES

Part Ⅱ: [Gly14]-Humanin Abolishes the Effects of Amyloid β Protein on NMDA and GABAA Receptor-Mediated Currents in Cultured Primary Rat Cortical Neurons

ABSTRACT

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

REFERENCES

Part Ⅲ: Effects of [Gly14]-Humanin on Amyloid β Protein-Induced Calcium Influx in Cultured Primary Rat Cortical Neurons

ABSTRACT

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

REFERENCES

综述 Humanin神经保护作用的研究进展

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