低氧诱导因子-1α在缺血后处理减轻心肌缺血/再灌注损伤中的作用

摘要

研究背景和目的: 世界卫生组织在《2007年全球卫生统计报告》中预测，到2030年缺血性心脏病将成为继癌症之后导致人类死亡的第二大疾病，而冠状动脉梗塞引起的心肌缺血是缺血性心脏病最重要的单因素致死原因。心脏是一个耗氧量很大的器官，且心肌不能进行无氧代谢，所以，当心肌缺血时，由于氧供给不能满足氧需求，会引起心肌细胞严重损伤，导致心肌舒缩功能障碍。因此，冠脉梗塞后及早再通闭塞的冠状动脉，有效恢复缺血心肌的血液灌注，是减少缺血性心肌损伤最有效的方法。然而动物实验和临床观察均证明，血管再通本身能引起额外的心肌损伤，即再灌注损伤，直接影响病人的预后。因此，如何减轻缺血/再灌注损伤，最大限度地保护缺血心肌，是有效治疗缺血性心脏病的关键。 一、后处理对缺血/再灌注心肌组织HIF-1α表达的影响。 目的: 1、观察后处理对缺血/再灌注心肌组织HIF-1α表达的影响； 2、分析HIF-1α表达水平与再灌注心肌损伤之间可能存在的关系。 方法： 1、选取成年Wistar大鼠30只，随机分为以下3组； (1)伪手术组(Sham，n=10)； (2)缺血/再灌注组(Control，n=10)； (3)缺血后处理组(PostC，n=10)。 2、心肌梗死面积测定：采用Evansblue和TTC双染法，正常的心肌组织被染成蓝色，缺血但未梗死的心肌组织被染为红色，梗死的心肌组织为白色。图像分析测定各区域面积。危险区面积(AAR/LV，％)=(危险区总面积/左心室面积)×100％心梗面积(An/AAR，％)=(梗死区面积/危险区总面积)×100％ 3、测定血清肌酸激酶(CK)的活性来进一步反映心肌损伤情况； 4、分别采用原位末端标记法(TUNEL)和Caspase-3活性测定法检测大鼠心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况； 5、用Western—blot法检测大鼠心肌组织中HIF-1α与iNOS的蛋白表达水平； 6、用免疫组化法测定心肌组织中HIF-1α的定位及表达； 7、用real—TimePCR法检测大鼠心肌组织中HIF-1α与iNOSmRNA的表达水平。 小结： 1、与缺血/再灌注相比，后处理使心肌组织中HIF-1α蛋白水平显著上调； 2、后处理减轻心肌缺血/再灌注损伤可能与其上调HIF-1α表达有关。 二、HIF-1α表达改变可以影响后处理对缺血心肌的保护效应。 目的: 1、采用药理学方法(DMOG，脯氨酸羟化酶的抑制剂)使心肌组织中HIF-1α表达上调，观察其对后处理减轻心肌缺血/再灌注损伤的影响； 2、模拟心肌缺血/再灌注，在培养的心肌细胞上制备缺氧/复氧及缺氧后处理模型，然后利用RNAi技术使心肌细胞的HIF-1α基因沉默，观察后处理对缺氧/复氧所致心肌细胞损伤的影响。 方法: 1、选取成年Wistar大鼠40只，随机平均分为以下4组； (1)缺血/再灌注组(Control，n=10)； (2)DMOG+缺血/再灌注组(DMOG+Control，n=10)； (3)生理盐水+后处理组(Vehicle+PostC，n=10)； (4)DMOG+后处理组(DMOG+PostC，n=10)。 2、心肌梗死面积测定：采用Evanseblue和TTC双染法测定缺血/再灌注所致的心肌梗死面积； 3、测定血清肌酸激酶(CK)的活性来进一步反映心肌损伤情况； 4、采用Caspase-3活性测定法反映大鼠心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况； 5、用Western—blot法检测大鼠心肌组织中HIF-1α及iNOS的蛋白表达水平； 6、用real—TimePCR法检测大鼠心肌组织中HIF-1α及iNOSmRNA的表达水平； 7、采用放射免疫法检测各组大鼠心肌组织中cGMP含量； 8、利用培养的H9c2心肌细胞模拟心肌缺血/再灌注建立缺氧/复氧及缺氧后处理模型： (1)常氧对照组：置于37℃95％空气，5％CO2中持续培养5h； (2)缺氧/复氧组：置于充满95％N2和5％CO2的三气培养箱内缺氧培养3h，然后再转入充满95％空气，5％CO2的常氧培养箱中复氧2h； (3)缺氧后处理组：缺氧培养3h后，复氧5min+缺氧5min，重复三次，然后再复氧培养1.5h； (4)DMOG+缺氧后处理：缺氧前在培养液中分别加入不同量的DMOG，使其终浓度分别为0.1mM，0.5mM以及1mM，其余操作同(3)； 9、检测心肌细胞存活率(CCK8法)，培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性变化以及caspase-3活性来反映缺氧/复氧及缺氧后处理对心肌细胞的影响； 10、利用RNAi技术使培养的心肌细胞HIF-1α基因沉默。 小结： 1、DMOG使心肌组织中HIF-1α蛋白水平上调，其上调程度同后处理的效应相同，而给予DMOG后再进行后处理，则可更进一步增加HIF-1α的蛋白表达，提示DMOG与后处理在增加HIF-1α表达方面具有叠加效应。给予DMOG并不影响HIF-1αmRNA的表达，说明其是在翻译后水平上对HIF-1α进行调节； 2、DMOG通过上调HIF-1α蛋白水平减轻了缺血/再灌注导致的心肌损伤，而且更进一步增强了后处理的保护效应，表现出DMOG与后处理的叠加效应，进一步提示HIF-1α表达上调与后处理的心肌保护机制可能存在着一定的联系； 3、DMOG上调心肌组织HIF-1α表达，以及增强后处理保护效应的同时，心肌组织iNOS表达与cGMP含量均发生相应的增加，提示HIF-1α可能通过其下游iNOS—cGMP通路参与后处理的保护机制； 4、HIF-1α基因沉默后，削弱了后处理对缺氧/复氧所致心肌细胞损伤的保护效应。 三、后处理可以减轻高脂血症大鼠心肌缺血/再灌注损伤。 目的： 1、建立食源性高脂血症大鼠模型，观察高脂血症对心肌缺血/再灌注损伤是否具有影响； 2、观察后处理是否可以影响高脂血症大鼠缺血/再灌注所致的心肌损伤； 3、观察高脂血症对心肌组织中HIF-1α表达的影响。 方法: 1、选取成年Wistar大鼠60只，体重120±10g，随机平均分为以下两大组； (1)正常饮食组(N=30)：普通饲料喂养8周，分别随机分为以下3组：①正常饮食—伪手术组(N—Sham，n=10)；②正常饮食—缺血/再灌注组(N—Control，n=10)；③正常饮食—缺血后处理组(N-PostC，n=10)。 (2)高脂血症组(N=30)：高脂饲料喂养8周后鼠尾采血测定血脂水平，随机平均分为以下3组：①高脂血症—伪手术组(HC—Sham，n=10)；②高脂血症一缺血/再灌注组(HC—Control，n=10)；③高脂血症—缺血后处理组(HC-PostC，n=10)。 2、采用比色法测定血脂水平； 3、心肌梗死面积测定：采用Evanseblue和TTC双染法测定心肌梗死面积； 4、测定血清肌酸激酶(CK)的活性来进一步反映心肌损伤情况； 5、采用Caspase-3活性测定法反映大鼠心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况； 6、用Western—blot法检测大鼠心肌组织中HIF-1α及iNOS的蛋白表达水平； 7、用real—TimePCR法检测大鼠心肌组织中HIF-1α及iNOSmRNA的表达水平。 小结： 1、后处理可以减轻高脂血症大鼠缺血/再灌注造成的心肌损伤； 2、高脂血症及后处理均可上调心肌组织中HIF-1α的蛋白水平，后处理减轻高脂血症大鼠心肌缺血/再灌注损伤可能与HIF-1α表达水平增加有关。 结论: 1、后处理可以减轻正常大鼠缺血/再灌注导致的心肌损伤； 2、后处理使缺血/再灌注心肌组织中HIF-1α蛋白表达明显增加； 3、HIF-1α参与了后处理的心肌保护机制，并可能通过iNOS—cGMP通路发挥作用； 4、后处理可以减轻高脂血症大鼠缺血/再灌注导致的心肌损伤，这种保护效应可能与心肌组织HIF-1α表达上调有关。

目录

文摘

英文文摘

声明

SECTION ONE Effects of Ischemic Postconditioning on Myocardial Injury Induced by Ischemia/Reperfusion and Hypoxia Inducible Factor-1αExpression

Abstract

Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

References

SECTION TWO Changes of Hypoxia Inducible Factor-1α with DMOG and siRNA influences the Cardioprotection Elicited by Ischemic Postconditioning

Abstract

Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

References

SECTION THREE Postconditioning Attenuates Myocardial Injury Induced by Ischemia/Reperfusion in Hyperlipidemic Rats and the Involvement of Hypoxia Inducible Factor- 1α Upregulation

Abstract

Introduction

Material and Methods

Results

Discussion

References

附图表1

附图表2

附图表3

Review NO-cGMP Singaling in Myocardial Ischemic Postconditioning

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