内毒素对大鼠原代肝星状细胞TGF-β1表达的影响及其机制的初步研究

摘要

实验一、大鼠肝星状细胞分离与培养方法的改良与体会
　　 目的：探讨一种经济易行的大鼠肝星状细胞的分离与培养方法，为今后从细胞及分子水平上研究肝纤维化的发病机理提供有利条件。
　　 方法：取成年大鼠，用两步酶液对其肝脏进行离体循环灌注，经两种密度的Nycodenze密度梯度高速离心(20000r/min)和细胞悬液低速离心(40× g)去杂质后得到原代HSCs。台盼兰拒染实验鉴定细胞活率，desmin和GFAP免疫细胞化学双抗单染色法鉴定刚分离的肝星状细胞的纯度。()-SMA免疫细胞化学AEC显色鉴定培养7天的细胞活化程度。
　　 结果：HSCs的得率为(3.6±0.1)×107/肝，HSCs存活率为(92.8±0.8)％，对培养24小时的HSCs行desmin和GFAP共同鉴定DAB显色，细胞阳性率为(96.2±0.5)％；取培养7天的细胞爬片做()-SMA做HSCs的活化鉴定AEC显色，细胞阳性率为(72.3±0.6)％。
　　 结论：改良法在保障大鼠原代HSCs产量的前提下提高了细胞纯度，有利于对原代大鼠HSCs生物学特性及肝纤维化机制的进一步研究。
　　 实验二、内毒素对大鼠原代肝星状细胞TGF-β1表达的影响及其机制的初步研究
　　 目的：观察内毒素刺激大鼠原代HSCs后TGF-β1表达的影响，探讨PDTC(NF-κB抑制剂)改善肝纤维化的机制。
　　 方法：用链酶蛋白酶液和胶原酶液离体灌注消化健康成年大鼠肝脏，Nycodenze密度梯度离心，得到原代HSCs，在含有内毒素终浓度分别为0.01、0.1、1、10μg/m1的培养液中培养，各浓度组分别在培养第2、4、8天时收集细胞培养上清液，-20℃保存，Elisa法测定TGF-β1含量。在含有各浓度内毒素的培养液中分别在第2、4、8天换成含PDTC终浓度为10μmol/L且含有原浓度内毒素的培养液，对照组在第2、4、8天时换成只含有原浓度内毒素未加PDTC的培养液，48小时后，收集细胞培养上清液-20℃保存，Elisa法测定TGF-β1含量。
　　 结果：内毒素直接刺激HSCs，分别在第2、4、8天测得的TGF-β1含量均高于对照组，且1μg/ml组TGF-β1的表达升高最多，其次为0.1μg/ml组，10μg/ml组和0.01μg/ml组。加入PDTC后，各组TGF-β1的表达量均低于对照组。
　　 结论：一定浓度的内毒素直接作用原代HSCs使其TGF-β1表达增加，提示内毒素可直接引起HSCs的活化，这可能是内毒素促进肝纤维化的途径之一。PDTC直接作用于HSCs可使TGF-β1表达降低提示我们PDTC可能是通过抑制核因子κB降低TGF-β1的表达来改善肝纤维化的，核因子κB可能是其靶点之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词表

声明

实验一大鼠肝星状细胞分离与培养方法的改良与体会

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

实验二内毒素对大鼠原代肝星状细胞TGF-β1表达的影响及其机制的初步研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述：转化生长因子β1与肝纤维化关系的研究进展

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