基于AuNP/GO纳米探针实现癌细胞内端粒酶及microRNA的原位检测及荧光呈像

摘要

癌症，又称为“恶性肿瘤”，是一种严重威胁人类健康及生命的常见病和多发病。对于那些死于癌症的人，如果癌症早期就能被诊断出，并得到有效的治疗，可大大提高其治愈率。事实上，由于恶性癌细胞一般生长于人体的组织器官内，不会被我们的免疫系统识别为一个外来物体，因此就现在的技术水平来说，癌症很难得到早期诊断。因此发展肿瘤的早期检测方法对于癌症预防和治疗都具有重要积极意义。
　　随着科技的进步和发展，越来越多的肿瘤标志物的发现和应用，为肿瘤的早期诊断提供了一个新的途径。其中，端粒酶及microRNA，是目前在分析检测领域研究较多的两种肿瘤标志物。另外，为了对体内内源性肿瘤标志物进行实时监测，需要一个非侵入性的、可重复监控、实时成像肿瘤标志物的原位检测方法。
　　本论文工作包括三个部分：
　　1、基于金纳米荧光耀斑探针细胞内原位成像技术检测端粒酶活性
　　制备金纳米粒子-DNA荧光耀斑探针，在AuNP探针中，长链HS-DNA，端粒酶Primer-DNA和Flare-DNA（合称混合DNA）通过碱基互补紧密结合在一起，然后，由于金-硫键作用将混合DNA结合到金纳米粒子上。末端的带有荧光基团FAM的Flare-DNA由于和金纳米粒子发生了荧光共振能量转移（FRET）而被淬灭，当AuNP探针在端粒酶的作用下AuNP探针上的引物-DNA会延长，从而把Flare-DNA竞争下来，荧光得以释放。因此，可以应用于癌细胞的原位成像，从而检测到细胞内端粒酶活性。
　　2、基于金纳米粒子和氧化石墨复合探针检测细胞内端粒酶活性及其原位成像
　　通过制备的金纳米粒子-DNA荧光耀斑探针，再结合氧化石墨烯-DNA探针，得到金纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合探针（AuNP/GO），在AuNP探针中，释放出被淬灭的Flare-DNA后，接着，用于石墨烯的信号富集及杂交链反应的信号放大，并利用核酸碱基互补杂交方式可实现对活细胞内端粒酶的灵敏检测，而且通过激光共聚焦显微镜的荧光成像技术可以实现正常细胞和癌细胞的区分。其中，GO探针的原理是模拟的杂交链反应（类HCR）系统，该探针是由两种FAM修饰的发卡序列（H1-DNA和H2-DNA）构成，其目的是为了形成像有引发剂（引发DNA）存在的杂交链反应一样，使两种发卡交替杂交形成双螺旋结构。因此，当AuNP探针释放的Flare--DNA作为GO探针上模拟杂交链系统的引发剂，引发H1和H2两种发卡序列形成双螺旋结构，释放出被淬灭的H1和H2上的FAM荧光基团，从而对信号起到了增强富集的作用。
　　3、基于纳米材料与HCR技术，实现对miR-21和Pre-miR-21的双重检测及细胞内原位成像
　　Pre-miRNA广泛存在于正常细胞中，细胞发生癌变后经过Dicer酶酶切为成熟miRNA。因此能准确识别成熟miRNA和其前体pre-miRNA，区分肿瘤细胞和正常细胞，对癌细胞早期诊断及治疗有重大意义。因此，我们利用核酸碱基互补杂交方式可实现对不同形式的microRNA（microRNA前体及成熟microRNA）的检测及细胞内荧光成像。首先，我们利用基于金纳米粒子的纳米耀斑探针特异性的直接识别pre-miRNA。这里用到的纳米耀斑探针也是由核苷酸双链修饰的金纳米粒子组成，该核苷酸通过金-硫键结合到金纳米粒子上，在目标分子pre-miRNA存在的情况下，由于pre-miRNA与HS-DNA有更强的杂交能力，因此会将Cy5修饰的Flare-DNA从金纳米探针上竞争下来，因此，可以从Cy5发出的荧光强度进而间接表明pre-miRNA的量。我们另外设计了一个负载DNA的氧化石墨烯探针，当目标分子miRNA存在的情况下，作为GO探针上模拟杂交链系统的引发剂，引发H1和H2两种发卡序列形成双螺旋结构，释放出被淬灭的H1和H2上的FAM荧光基团，因此实现对miRNA的检测。
　　值得一提的是，通过合成端粒酶和microRNA的抑制剂，可以清楚的观察到细胞内，端粒酶和microRNA的活动性变化，对深入研究癌细胞内变化特征有更直观的认识，并且对癌症的早期发现、监控、靶向药物治疗都有重大意义。

目录

声明

前言

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 纳米材料概述

1.3 肿瘤标志物检测概述

第二章 基于金纳米粒子荧光耀斑细胞内原位成像技术检测端粒酶活性

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第三章 基于金纳米粒子和氧化石墨烯复合探针检测细胞内端粒酶活性及其原位成像

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 小结

第四章 基于金纳米耀斑探针及氧化石墨烯负载的HCR技术实现对成熟miR-21和miR-21前体的细胞内双重原位检测及荧光成像

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 结论

总结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文