青蒿素类抗疟药大鼠体内自身诱导代谢机理的研究

摘要

目的：青蒿素类抗疟药是含内过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物。近年来研究发现这类药物具有自身诱导代谢现象，且青蒿素类药物在人体内由CYP2B6和CYP3A4介导代谢，并能诱导CYP2C19。而核受体超家族是介导CYP450诱导的关键调控因子，其中主要有孤儿核受体孕烷X受体(PXR)及组成型雄烷受体(CAR)。青蒿素类药物是否通过激活核受体PXR或CAR而导致其对CYP450的诱导，目前尚不清楚。本文选择青蒿素类衍生物的母体化合物青蒿素(ART)及该类衍生物的活性代谢物双氢青蒿素(DHA)作为目标药物，以CYP2B、CYP3A和CYP2C为考察目标，从药物代谢角度，采用分子生物学方法(PCR、Westernblot)，在体内条件下，探讨了该类药物对CYP450的诱导机制。
　　 方法：将SD大鼠随机分成8组(每组6只)。口服ART诱导组：80mg/kg/d；口服DHA诱导组：10 mg/kg/d；口服溶剂对照组；静注ART诱导组：16mg/kg/d；静注DHA诱导组：5mg/kg/d；静注溶剂(ART)对照组；静注溶剂(DHA)对照组；空白对照组：不经任何处理。均连续给药5天，末次给药24h后处死大鼠，取出肝脏，用于mRNA、酶活性和蛋白的测定。
　　 结果：(1)mRNA的测定：取肝组织，Trizol一步法提取总RNA，采用实时荧光定量PCR检测PXR、CAR、CYP3A1、CYP2B1及CYP2C6 mRNA。2-△△Ct法计算相对定量结果。相比溶剂对照组和空白对照组，口服ART和DHA诱导组大鼠CYP2B1 mRNA水平显著增加(P＜0.001)，口服ART诱导组大鼠CARmRNA水平显著增加(P＜0.001)，而静注ART和DHA诱导组大鼠核受体及CYP450 mRNA水平与对照组间均无显著性差异。(2)酶活性的测定：超速离心法制备肝微粒体，并用紫外分光光度法测定蛋白浓度及CYP450含量。口服ART诱导组CYP450含量为：1.45nmol/mg；口服DHA诱导组CYP450含量为：1.38 nmol/mg；口服溶剂对照组CYP450含量为：0.81nmol/mg；空白对照组CYP450含量为：0.79 nmol/mg；静注ART诱导组CYP450含量为：0.75nmol/mg；静注溶剂(ART)对照组CYP450含量为：0.78nmol/mg；DHA多剂量静注诱导组CYP450含量为：0.79nmol/mg；静注溶剂(DHA)组CYP450含量为：0.84nmol/mg。相比溶剂对照组和空白组，口服ART和DHA诱导组大鼠CYP450含量均较高。Nash法测定微粒体中CYP3A同工酶催化的红霉素N-去甲基化酶活性。口服ART诱导组单位时间内甲醛生成量为：2.29μmol/mg/min；多剂量DHA口服诱导组单位时间内甲醛生成量为：1.75μmol/mg/min；口服溶剂对照组单位时间内甲醛生成量为：0.82μmol/mg/min；空白对照组单位时间内甲醛生成量为：0.75μmol/mg/min；静注ART诱导组单位时间内甲醛生成量为：0.72μmol/mg/min；静注溶剂(ART)对照组单位时间内甲醛生成量为：0.75μmol/mg/min；静注DHA诱导组单位时间内甲醛生成量为：0.79μmol/min；静注溶剂(DHA)对照组单位时间内甲醛生成量为：0.85μmol/mg/min。相比溶剂对照组和空白组，口服ART和DHA诱导组大鼠CYP3A1酶活性较高。荧光分光光度法测定微粒体中CYP2B同工酶活性。口服ART诱导组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：10.30×10-3μmol/mg/min；口服DHA诱导组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：8.19×10-3μmol/mg/min；口服溶剂对照组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：5.68×10-3μmol/mg/min；空白对照组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：5.41×10-3μmol/mg/min；静注ART诱导组单位时间内9-羟基-3一异恶唑生成量为：5.24×10-3μmol/mg/min；静注溶剂(ART)对照组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：5.26×10-3μmol/mg/min：静注DHA诱导组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：5.25×10-3μmol/mg/min；静注溶剂(DHA)对照组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：5.74×10-3μmol/mg/min。相比溶剂对照组和空白组，口服ART和DHA诱导组大鼠CYP2B1酶活性较高。高效液相色谱法测定CYP2C6底物双氯芬酸钠经微粒体孵化后剩余量以检测CYP2C6酶活性。口服ART诱导组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：31.20％：口服DHA诱导组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：18.02％；口服溶剂对照组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：16.54％；空白对照组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：16.37％；静注ART诱导组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：15.59％；静注溶剂(ART)对照组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：16.02％：静注DHA诱导组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：16.41％：静注溶剂(DHA)对照组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：17.93％。相比溶剂对照组和空白组，口服ART诱导组大鼠CYP2C6酶活性较高。(3)蛋白的测定：提取肝组织总蛋白，Westem blot测定PXR和CAR蛋白，对比对照组，实验组无统计学意义(P＞0.05)；制备的肝微粒体，Westernblot测定CYP3A1、CYP2B1及CYP2C6蛋白，对比对照组，实验组无明显差别。
　　 结论：以上结果表明，多剂量口服青蒿素能上调大鼠CAR受体及CYP2B的mRNA水平；多剂量口服双氢青蒿素能够上调CYP2B mRNA水平。青蒿素类药物很有可能是通过激活核受体CAR而进一步诱导CYP2B表达。另一方面多剂量口服青蒿素和双氢青蒿素均使CYP450酶活性增强，该类药物诱导了CYP450酶活性而加速了自身代谢。而多剂量静注青蒿素和双氢青蒿素对核受体mRNA水平及CYP450s mRNA水平和酶活性均没有影响。说明青蒿素类药物对于CYP450的诱导作用基于首过代谢。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1主要仪器

2.1.2药品与试剂

2.1.3实验动物

2.2方法

2.2.1动物给药方案

2.2.2青蒿素类药物对核受体和CYP450s mRNA表达水平的影响

2.2.3青蒿素类药物对CYP450酶活性的影响

2.2.4青蒿素类药物对大鼠肝脏核受体和CYP450酶蛋白表达水平的影响

3结果

3.1青蒿素类药物对大鼠肝核受体和CYP450s mRNA的影响

3.1.1青蒿素对大鼠肝脏核受体mRNA水平的影响

3.1.2双氢青蒿素对大鼠肝脏核受体mRNA水平的影响

3.1.3青蒿素对大鼠肝脏CYP450s mRNA水平的影响

3.1.4双氢青蒿素对大鼠肝脏CYP450s mRNA水平的影响

3.2青蒿素类药物对CYP450酶活性的影响

3.2.1标准曲线制备

3.2.2蛋白浓度测定及CYP450含量测定

3.2.3青蒿素类药物对CYP3A1酶活性的影响

3.2.4青蒿素类药物对CYP2B1酶活性的影响

3.2.5青蒿素类药物对CYP2C6酶活性的影响

3.3青蒿素类药物对大鼠肝脏核受体和CYP450蛋白的影响

3.3.1青蒿素对大鼠肝脏核受体和CYP450酶蛋白的影响

3.3.2双氢青蒿素对大鼠肝核受体和CYP450酶蛋白的影响

4讨论

4.1青蒿素类药物对大鼠肝内核受体和CYP450s mRNA水平的影响

4.2青蒿素类药物对大鼠肝脏核受体和CYP450酶活性的影响

4.3青蒿素类药物对大鼠肝脏核受体和CYP450酶蛋白的影响

5结论

参考文献

个人简介

致谢