氟诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡及机制研究

摘要

目的:氟(Flurine)是一种非金属元素,也是人体必需的一种微量元素。氟具有强大的电负性,以氟化物(Fluoride)的形式广泛存在于自然界中。摄入适量的氟有利于机体预防龋齿、维持钙磷代谢和保持神经冲动传导,而过量的氟化物则对机体产生强烈的毒性作用,能引起机体多系统损害。过去,人们多以氟对骨相组织的损害为研究重点,但近年来,随着氟化物在工农业生产和生活中的广泛应用,氟对机体生殖系统等非骨相组织的毒性作用逐渐被人们所重视。因此,关于氟致雄性生殖毒性的研究日益受到关注。
　　 本课题通过动物体内和体外两部分实验,研究氟中毒对睾丸组织及间质细胞凋亡的影响。通过建立氟中毒小鼠模型,研究对小鼠睾丸组织损伤和细胞凋亡的影响；建立并优化睾丸间质细胞培养条件与方法,观察不同冻存复苏条件对细胞生物学特性的影响；观察不同浓度氟化钠对睾丸间质细胞增殖和细胞凋亡的影响及其相关蛋白表达,为氟中毒的机制研究提供依据。
　　 方法:
　　 (1)体内实验:动物体内实验采用给小鼠饮用含0,10,25,50mg／L氟化钠的加氟水,制作动物中毒模型,观察动物临床表现及病理切片,研究氟对睾丸组织的损伤,并用原位细胞凋亡标记技术,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL法)检测小鼠睾丸细胞凋亡的变化。
　　 (2)体外实验:采用2种酶消化法分离纯化睾丸间质细胞并寻求较适宜的培养条件,原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征。取体外培养的睾丸间质细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,常规培养,待细胞融合率达80％,且未出现细胞分化时,将细胞分为4组,加入不同浓度的氟化钠染毒(0,5,10,20mg／L)睾丸间质细胞,分别染毒0,24,48,72,96,120h后采用MTT法检测各组细胞的增殖情况,观察细胞的形态变化。染毒48h后采用流式细胞仪AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡率。采用免疫组织化学法检测氟对小鼠睾丸质细胞的凋亡作用,检测Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白的表达水平。
　　 结果:
　　 (1)氟中毒能诱导小鼠睾丸TUNEL阳性细胞,且高氟组凋亡细胞率较对照组明显增高。
　　 (2)胶原酶Ⅳ和0.25％胰蛋白酶限时消化能够获得较高存活率(>92％)的小鼠睾丸间质细胞；37℃、5％CO2条件下细胞生长良好,采用逐步降温法和使用DMSO为冻存剂细胞复苏率较高。
　　 (3)氟作用24h,48h后,20mg／L的氟对睾丸间质细胞增殖率有明显抑制作用,而5mg／L和10mg／L的组没有明显影响；10mg／L氟作用72h后,明显抑制睾丸间质细胞的增殖；5,10,20mg／L各浓度氟作用96h和120h后均表现明显抑制作用。
　　 (4)不同浓度氟对睾丸间质细胞作用48h后,均可诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡。氟浓度为10mg／L时,晚期凋亡率最高。氟浓度为20mg／L时,早期凋亡率最高。
　　 (5)免疫细胞化学实验表明:随氟浓度的增加Caspase-3、Caspase-9、Bax阳性表达率增加,灰度值降低,蛋白表达增强；Bcl-2阳性表达率降低,灰度值升高,蛋白表达减弱。
　　 结论:
　　 (1)本研究表明氟中毒可诱导小鼠睾丸组织细胞凋亡,凋亡发生部位与病理改变明显的部位相吻合,并且睾丸损害过程中有细胞凋亡机制参与。
　　 (2)建立了睾丸间质细胞体外培养体系,为进一步研究氟中毒提供技术方法和实验依据。
　　 (3)氟对小鼠睾丸间质细胞的增殖有抑制作用,诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡,并且Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表达随染毒剂量的增加呈上升趋势,而Bcl-2蛋白表达呈下降趋势,说明这些蛋白在氟引起睾丸间质细胞凋亡过程中起到了调控作用。