纤溶酶原激活物抑制因子-1对肝星状细胞活化及其细胞外基质的影响

摘要

研究目的：肝纤维化已经成为严重危害人类健康的疾患，肝星状细胞活化是肝纤维化的中心环节，而肝纤维化形成关键是基质的产生。转化生长因子（transforming growth factor-β1,TGFβ1）已知是促进肝纤维化最强的细胞因子，它可促进肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）活化和增殖,促进细胞外基质的产生。HSC通过产生细胞因子影响着肝纤维化的发生和发展。有研究表明HSC可表达纤溶酶原激活物抑制因子-1（plasminogen activator inhibitor type-1,PAI-1），参与肝纤维化的发生发展，TGFβ1可促进HSC PAI-1的表达。外源性PAI-1能否影响肝星状细胞TGFβ1表达，以及细胞外基质的合成目前尚不清楚。本实验通过体外培养肝星状细胞，研究外源性PAI-1对肝星状细胞活化及细胞外基质的影响。
　　 研究方法:人肝星状细胞LX-2贴壁细胞培养；MTT法测定PAI-1对LX-2细胞的最佳干预浓度；采用ELISA法测定细胞上清液中透明质酸（hyaluronic acid,HA）、TGFβ1、基质金属蛋白酶抑制抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-1）；免疫细胞化学法检测ɑ-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,ɑ-SMA）、基质金属蛋白酶-2（matrixmetallo proteinase-2，MMP-2）、TIMP-1、PAI-1、尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator, uPA）蛋白表达；逆转录聚合酶链反应(reverse transcription ploymerase chain reaction, RT-PCR)检测TGFβ1及PAI-1mRNA的表达，并分析两者相关关系。
　　 结 果：1、PAI-1对LX-2细胞增殖刺激作用明显，且PAI-1浓度为10ng/ml时刺激作用最为明显，A492为1.636±0.315（F=11.697, p<0.01)。
　　 2、ɑ-SMA在LX-2胞浆中表达，核内无明显表达。PAI-1干预12h组蛋白表达量为（0.408±0.031）较对照组（0.301±0.015）增加明显（t=5.438, p<0.01）。
　　 3、MMP-2、TIMP-1、 PAI-1、uPA在LX-2胞浆中表达，核内无明显表达。PAI-1干预12h组MMP-2蛋白表达量为（0.245±0.028）较对照组（0.233±0.041）仅轻微增加（t=0.473, P>0.05)；uPA 12h组为（0.303±0.052）较对照组（0.288±0.036）增加不明显（t=0.581, P>0.05）；PAI-112h组为（0.331±0.045）较对照组（0.205±0.007）增加显著（t=4.857，P<0.01）；TIMP-112h组为（0.412±0.031）较对照组（0.235±0.011）增加显著（t=9.511,P<0.01）。
　　 4、PAI-1干预12h后TGFβ1mRNA、PAI-1mRNA分别为（1.839±0.405），（2.325±0.970），对照组分别为（1.090±0.123），（0.790±0.156），两者相比差异显著。且TGFβ1mRNA与PAI-1mRNA呈正相关（r=0.827，P<0.05）。
　　 5、在细胞上清液中加入PAI-112h，24h，48h后（刺激组）TGFβ1蛋白表达量分别为（8.854±3.168）、（44.348±8.415）、（225.819±12.797）pg/ml，对照组为（0.855±0.744）pg/ml，干预组较阴性对照组增加显著(F=1566.752，P<0.01)；HA分别为（2.577±0.801）、（18.177±7.141）、（50.473±4.903）ng/ml，对照组（0.450±0.154）ng/ml，干预组较阴性对照组增加显著（F=235.632，P<0.01)；TIMP-1分别为（2.872±1.396），（20.409±11.821），（96.548±27.154）ng/ml，对照组（0.573±0.179）ng/ml，干预组较阴性对照组有统计学意义（F=67.359,P<0.05）。
　　 结论：PAI-1可刺激肝星状细胞活化，增加TGFβ1表达，增加细胞外基质合成，促进肝纤维化发生发展。

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