孕期暴露苯并[a]芘对子代大鼠神经发育毒性的影响-组蛋白去乙酰化酶在其致神经细胞凋亡中的作用

摘要

【目的】从体内实验探讨孕期暴露苯并[a]芘对仔鼠神经发育及学习记忆的影响，并通过体内外实验进一步探讨HDAC1、HDAC2及BDNF等在苯并[a]芘致神经细胞凋亡中的作用。
　　 【方法】1.动物体内实验研究：1）SD 孕鼠随机分为5组，于妊娠第17天每天1次连续3天腹腔注射染毒，分为空白对照组、溶剂对照组、25、50、100mg/kg B[a]P组，待其自然分娩。2）①PND1、4、7、14、28 称量体重，检测发育指标；②Morris水迷宫和旷场实验分别检测仔鼠的学习记忆能力和对新异环境的适应能力；③PND1、4、7、14、28 每组处死3只仔鼠取脑组织作病理切片，用硫堇染色及TUNEL 实验分别观察海马神经元损失及凋亡情况；④QRT-PCR、免疫组化法和Elisa 法检测仔鼠脑组织HDAC1、HDAC2、caspase-3、BDNFmRNA及蛋白的表达。
　　 2.体外实验研究：1）大鼠原代神经细胞培养，分为两批：第一批分4个组，以B[a]P同时加入S9对细胞染毒，分为DMSO、低、中、高剂量组，使其终浓度为0、10、20、40μmol/L；第二批分5个组，以20μmol/LB[a]P 染毒，分别于染毒0、6、12、24、48h 处理细胞。2）①MTT 法和流式细胞术分别检测神经细胞活力及凋亡率；②HAT/HDAC activityassay kit 检测HAT/HDAC的活性；③QRT-PCR、Western-blot 法和Elisa 法检测神经细胞HDAC1、HDAC2、caspase-3、BDNFmRNA及蛋白的量效和时效表达。
　　 【结果】1.①神经发育指标测试：同一时点染毒组仔鼠体重与对照组比较逐渐降低（P<0.01，P<0.05）；与空白对照组、溶剂对照组相比较，中、高剂量组仔鼠张耳时间[(4.1±0.4)、(5.0±0.4)d]延长（P<0.01）。PND4与空白对照组相比（36.1％），高剂量组平面翻正实验达标率（6.5％）明显降低，PND7与空白对照组、溶剂对照组（80.3％、79.3％）相比，高剂量组平面翻正实验达标率（50.0％）明显降低（P<0.05）。与空白对照组比较，PND12、14 各染毒组仔鼠前肢悬挂时间均减少（P<0.01）。与空白对照组相比（94.3％），PND12 高剂量组嗅觉定向实验达标率（61.9％）明显降低（P<0.05）；②学习记忆能力测试：Morris水迷宫实验结果表明与空白对照组和溶剂对照组比较，各剂量组仔鼠逃避潜伏期明显增加，高剂量组在目标象限停留时间和穿越平台次数减少（P<0.01）。旷场实验结果表明，与空白对照组比较，中、高剂量组仔鼠中央格停留时间明显延长，跨格次数明显减少，高剂量组直立次数明显减少（P<0.05）；与溶剂对照组相比，各剂量组跨格次数明显减少（P<0.01，P<0.05）；③硫堇染色病理组织结果：空白对照组及溶剂对照组仔鼠海马细胞数量较多，连接紧密，排列规则，神经元尼氏较深；随着染毒剂量的增高，细胞数量逐渐减少，排列逐渐紊乱，连接松解，神经元尼氏体着色较对照组浅，核固缩，核周出现轻度空泡变性；④TUNEL 结果：同一时点AI 随染毒剂量增加而增高（P<0.01，P<0.05）；⑤基因、蛋白检测结果：各组HDAC1、HDAC2、caspase-3mRNA和蛋白的表达水平随染毒剂量的增加逐渐增加, BDNF的表达则下降。与空白对照组相比，高剂量组BDNF mRNA的表达至少减少了50％（P<0.01，P<0.05）。PND28 仔鼠血浆中BDNF蛋白水平高剂量组与空白对照组、溶剂对照组相比分别下降了68％、75％（P<0.01，P<0.05）。
　　 2.①细胞活力和凋亡率检测结果：不同染毒剂量及时间下，细胞活力显著下降。40μ
　　 mol/L组神经细胞存活率与DMSO组相比显著减少了50％（P＜0.01），48h组与0h组相比也减少了50％（P＜0.01）.与DMSO组相比，20、40μmol/L组神经细胞的凋亡率明显增加（P＜0.05），40μmol/L组凋亡率与10μmol/L组相比也明显增加（P＜0.05）；与0h组相比，24、48h组神经细胞的凋亡率明显增加（P＜0.05）；②HAT/HDAC 活性测试结果：与DMSO 相比， 40μmol/L组HAT 活性显著下降了47％（P<0.05），而HDAC 活性明显增加了59％（P<0.01）；与0h 相比，48h组HAT 活性显著下降了68％（P<0.01），而HDAC活性增加了142％（P<0.01）；③基因检测结果：与DMSO组相比，染毒组HDAC1基因表达有上升趋势，但差异无统计学意义；40μmol/L组HDAC2、caspase-3mRNA的表达量较对照组明显增加，而BDNF mRNA下降(P<0.01)；与0h组相比，48h组HDAC1、HDAC2、caspase-3 mRNA表达明显升高， BDNF表达显著下降(P<0.01,P<0.05）；④蛋白检测结果：与DMSO组相比，40μmol/L组HDAC、HDAC2、caspase-3蛋白的表达量明显增加（P<0.05）；与0h组相比，24h、48h组caspase-3蛋白，48h组HDAC1、HDAC2蛋白的表达量明显增加（P<0.05）。不同染毒剂量及时间下BDNF蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）。
　　 【结论】孕期暴露B[a]P对仔鼠的神经发育有一定的抑制作用，并可使仔鼠脑组织神经细胞形态结构发生改变，海马神经细胞凋亡，且剂量越高损伤越严重；从体外实验和动物体内实验两方面研究发现，HADC1、HDAC2 可能在B[a]P 所导致的神经细胞凋亡起重要作用，可能与B[a]P作用后，HDAC1、HDAC2表达上调，组蛋白乙酰化水平减低，导致BDNF表达下降，进而引起神经细胞凋亡有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

声明

前言

第一部分孕期暴露B[a]P对子代大鼠神经发育毒性的影响

第二部分HDAC在苯并[a]芘致体外神经细胞凋亡中的作用

第三部分HDAC在苯并[a]芘致体内神经细胞凋亡中的作用

小结

综述组蛋白去乙酰化酶在细胞凋亡及神经可塑性中的作用

个人简历

致谢