硫磦呤类药物安全性监测体系的建立

摘要

抗代谢药:硫鸟嘌呤(6-thioguanine,6-TG),6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)及硫唑嘌呤(Azathioprine,AZA)均为嘌呤拮抗剂,这类药物通过干扰嘌呤代谢的所有环节,抑制嘌呤核苷酸的合成,进而抑制细胞DNA、RNA及蛋白质的合成。在临床上,硫嘌呤类药物除用于治疗急性白血病外,主要作为免疫抑制剂广泛用于器官移植以及自身免疫疾病的治疗。但是此类药物的治疗存在很大的个体差异。药物个体疗效的不确定性和对于药物严重毒副作用的顾虑都限制了硫嘌呤类药物在患者中的使用,主要原因是临床缺乏相应的预测方法,这一矛盾在国内尤为突出。
　　 目前,临床上通过定期监测服用硫嘌呤类药物患者的血象来指导其合理用药。研究发现药物活性物质的水平和降低的红细胞计数、降低的血小板计数、降低的白细胞计数、降低的中性粒细胞计数呈正相关[1]。因此定期进行常规的血细胞计数有助于诊断此类药物的血液毒性,但是常规的血象监测难以预测毒性的危险性,通常在血细胞计数发生改变之前,骨髓已受到一定损害,在血常规改变之后,骨髓的造血功能已受严重影响,血中药物活性物质浓度已高出正常治疗浓度[2],导致硫嘌呤类药物不良反应增多,甚至造成严重的医疗事故。
　　 众多研究表明,硫嘌呤类药物治疗的个体差异与其代谢途径密不可分。这类药物本身均无生物活性,必须经过体内一系列的酶代谢途径,最终生成有活性的6-硫代鸟嘌呤核苷酸(6-thioguanine nucleotides,6-TGNs)产生细胞毒效应而发挥疗效,但其亦是骨髓抑制的主要原因。6-TGNs在体内的浓度决定了此类药物的有效性和毒性。而巯嘌呤甲基转移酶(thiopurine methyltransferase,TPMT)作为硫嘌呤类药物代谢途径中重要的代谢酶,竞争性抑制6-TGNs的生成,进而影响药物的疗效及毒副作用。临床研究表明,TPMT活性在不同个体之间有很大的差异。如果患者TPMT活性较低或遗传有TPMT缺陷,即使给予常规剂量的药物,也会生成过多有活性的6-TGNs,大大增加了骨髓抑制的风险[3,4],另一方面,具有TPMT高活性的患者,在常规剂量下却很难达到治疗效果,而且过多的甲基化产物的生成可能导致肝脏毒性的发生[5.6]。
　　 TPMT基因多态性是造成TPMT酶活性个体差异的主要原因,目前对于中国汉族健康人群的TPMT活性分布及基因多态性分布情况已见报道,汉族健康人群的TPMT活性呈正态分布,且TPMT*3C为最主要的突变等位基因[7]。TPMT基因突变导致TPMT活性降低[8],TPMT野生纯合子对应TPMT高活性,TPMT*3C突变基因杂合个体显示TPMT中等活性,而突变纯合子对应TPMT活性缺乏。鉴于以上情况,本研究对收集的114例自身免疫疾病患者进行了TPMT*3C的筛选和TPMT酶活性的检测,以期建立硫嘌呤类药物安全性监测体系,为临床提供个体化用药依据。
　　 1.建立引物特异性TaqMan聚合酶链反应检测TPMT*3C突变
　　 1.1标本来源
　　 114例自身免疫疾病患者,包括39例类风湿性关节炎,33例白塞综合症,22例干燥综合症,20例间质性肺炎。所入选的患者均为汉族人,性别、身高、体重不限,年龄范围3—68,性别男性87例,女性27例。以直接调查方式获得相关资料,包括:年龄、性别、体重、民族、合并药物以及不良反应等。
　　 1.2方法
　　 参照OMEGA公司的SE Blood DNA Kit试剂盒说明书从患者全血标本中提取基因组DNA。应用引物特异性TaqMan聚合酶链反应(PS-TaqMan PCR)检测114例临床标本的TPMT*3C突变。每个模板DNA分别用野生型引物探针对及突变型引物探针对检测,野生型引物探针对反应管标为A管,Ct值记作CtA,突变型引物探针对反应管标为B管Ct值记作CtB,CtA与CtB的差值记作ΔCt。
　　 为保证PS-TaqMan PCR检测结果的准确性和重复性。①每次检测均设野生型和突变型质控模板,质控模板为经过分型验证的接近检测浓度下限的DNA,两种质控模板均需正确分型;②每一样本均用野生型和突变型两套引物探针检测,ΔCt需大于6或小于3,并且其中一个Ct值需小于30。前者是防止非特异性扩增对结果判断的干扰,后者是杜绝由于标本中模板量不足或其他因素造成扩增体系效率不高而带来的结果误判。
　　 此法主要利用DNA聚合酶扩增过程中的保真性原理,适当人为扩大引物与模板结合时的错配比例,把突变型模板与野生型模板之间一个碱基的差异放到可以通过简单观察两者不同的实时荧光定量扩增曲线来区分。此法省去了传统的限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)繁琐的操作,快捷简便适合于大规模的临床样本分析。
　　 1.3结果
　　 在所收集的114例全血标本中,筛查出2例TPMT*3C突变杂合子,经基因公司测序表明扩增曲线图有差别的两例患者确实为基因突变。TPMT*1／*3C在本研究中的基因型频率是1.8％。反应结束后,设置合适的基线(通常为3～8)和阈值(通常为最强荧光信号的1／10),得到CtA及CtB值,若CtA<30且CtB—CtA>6,则样本为TPMT*1型；若CtB<30且CtA—CtB>6,则样本为TPMT*3C型；若CtA<30,CtB<30且｜CtB—CtA｜<3,则样本为TPMT*1／*3C型。
　　 2.建立高效液相色谱法(HPLC)测定TPMT活性
　　 2.1标本来源
　　 114例自身免疫疾病患者,包括39例类风湿性关节炎,33例白塞综合症,22例干燥综合症,20例间质性肺炎。患者采血前3个月内无输血史,且均未服用硫嘌呤类药物。所入选的患者性别、身高、体重不限,均为汉族,其中男87例,女27例,年龄3-68岁。以直接调查方式获得相关资料,包括:年龄、性别、体重、民族、合并药物以及不良反应等。
　　 2.2方法
　　 2.2.1样品处理方法
　　 主要参照Weinshiboum及黄民教授报道的方法处理血标本[9]。应用高效液相色谱法(HPLC)测定114例临床标本的TPMT活性。①血标本处理:取肘静脉血4ml,血样置于肝素锂抗凝管中,6小时内低温离心分离红细胞,生理盐水洗涤三遍,离心弃上清,测红细胞压积,加入4倍冷蒸馏水裂解红细胞,离心后取上层透明液,置于-20℃保存。②酶活性的测定:采用改良的高效液相色谱法测定红细胞TPMT活性,用37℃时每小时每毫升压实红细胞生成6-MMP的纳摩尔数来表示TPMT活性。取样品于冰上解冻后,取红细胞裂解液200μl,加入200μl(150mmol／L,pH7.5)磷酸钾缓冲液,40μl(SAM 200μmol／L,DTT2.0mmol／L,别嘌呤醇200μmol／L)SAM、DTT和别嘌呤醇的混合液,10μl(100mmol／L)6-MP后,将摇床置于37℃恒温干燥箱中,样本孵育1h后加入50μl(1mol／L)的盐酸终止反应。上述混合物加入25μl(114mg／L)甲硝唑溶液作为内标,涡旋混匀。再加入0.8mL(pH9.5)氯化氨缓冲液,3ml的乙酸乙酯,涡旋2min,离心,取上层液,重复萃取一次,共收集上层液4ml,37℃水浴氮气吹干。用100μl流动相复溶,取20μl进样分析。
　　 2.2.2标准曲线的制备
　　 以6-MMP标准液(56mg／L)为母液配制浓度为0.7,2.8,3.5,5.6,7,11.2mg／L的标准溶液。分别吸取200μl红细胞裂解液于6支1.5mlEP管内,精密加入以上不同浓度的6-MMP对照品溶液10μl,(使加入200μl磷酸钾缓冲液、40μlSAM、DTT和别嘌呤醇的混合液和50μlHCL后,0.5ml反应液中6-MMP的浓度分别为14,56,70,112,140,224μg／L)。按上述血标本处理方法对TPMT进行孵化(不加入底物6-MP)和提取后,进行测定。以6-MMP与内标MNZ的峰高比定量,峰高比(y)与6-MMP浓度(x)做线性回归,求回归方程,绘制标准曲线。
　　 2.2.3回收率与精密度试验
　　 分别吸取200μl红细胞裂解液于1.5mlEP管中,精密加入高、中、低(7,5.6,1.75 mg／L)3种浓度的6-MMP标准溶液10μl(使孵化反应后0.5ml反应液中6-MMP的浓度分别为140,112,35μg／L),再按上述血标本处理方法操作(不加入底物6-MP)并进行分析,求得6-MMP在红细胞裂解液中的回收率。在同一天内和不同天间对以上3个浓度的6-MMP标准红细胞裂解液样品重复处理5批(不加入底物6-MP),并进样分析,求日内和日间RSD。
　　 2.2.4TPMT稳定性试验
　　 选取3份健康受试者的全血标本,将制得的红细胞裂解液-70℃冰箱保存。分别将红细胞裂解液反复冻融3次及-70℃冰箱保存30天后测定TPMT活性,与制备好时立即测定的TPMT活性结果进行比较。考察红细胞裂解液样本中TPMT在冻融、冰冻条件下存放不同时间的稳定性。
　　 2.3结果
　　 2.3.16-MMP标准曲线
　　 以6-MMP与内标MNZ的峰高比定量,峰高比(y)与6-MMP浓度(x)做线性回归,回归方程为:y=0.0018x+0.0768(n=6,r=0.9911),6-MMP浓度在14～224μg／L内具有良好的线性关系,通过标准曲线计算所得的6-MMP浓度是指红细胞裂解液在孵化反应结束后,6-MMP在0.5ml反应液中的浓度。在上述条件下测得6-MMP的最低检测浓度为6μg／L。
　　 2.3.2方法的回收率和精密度
　　 高、中、低3种浓度的平均回收率为92％,表明该方法具有较好的准确性。高、中、低3个浓度日内及日间变异均小于7％,表明该方法具有较好的精确度。
　　 2.3.3TPMT活性的稳定性
　　 红细胞裂解液样本在反复冻融3次及-70℃冰冻条件下存放四周后,TPMT活性与制备好立即测定的活性相近,表明红细胞裂解液样本在反复冻融3次及-70℃冰冻条件下存放四周后TPMT活性仍稳定。
　　 2.3.4样本的测定
　　 对收集的114例全血标本进行TPMT酶活性的测定,参考吴珏珩及黄民教授[10]所测TPMT活性范围:4.36～22.52 nmol／h·ml Packed RBC(平均活性为11.96±3.27 nmol／h·mlPacked RBC),发现两例突变患者中有一例TPMT酶活性为3.71 nmol／h·ml Packed RBC低于下限值。
　　 结论:
　　 (1)本研究所建立的引物特异性TaqMan聚合酶链反应(PS-TaqMan PCR)法用于检测TPMT*3C突变。该方法可靠、高通量且效率高,与传统的聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)法相比,省去了繁琐的操作,更简便、准确,更适合大规模的临床样本分析。
　　 (2)对已经服用硫嘌呤类药物的患者,因此类药物自身的干扰影响TPMT活性测定的结果,建议通过检测TPMT*3C的突变为临床用药提供依据。
　　 (3)由于筛查出的TPMT*3C基因突变例数太少,在本研究中还不能得出TPMT*3C突变杂合子TPMT平均活性明显低于野生型TPMT基因(TPMT*1)纯合子的TPMT平均活性。因此还有待于大样本的进一步研究。
　　 (4)对未服用硫嘌呤类药物的患者,因TPMT活性能较好的预测早期药物毒副作用的发生及治疗疗效,指导药物治疗剂量,建议通过测定TPMT的活性为临床个体化给药提供依据。
　　 (5)本实验所建立的HPLC用甲硝唑做内标测定红细胞裂解液中6-MMP浓度,两者分离较好,且红细胞裂解液中的内源性杂质不干扰6-MMP的测定。6-MMP在14～224μg／L内具有良好的线性关系,最低检测浓度为6 μg／L。方法回收率稳定,日内及日间变异均小于7％,符合生物样品分析要求,适用于临床监测。
　　 (6)由于受到研究样本量的局限性,本研究在实验中先参考了吴珏珩及黄民教授[10]所建立的TPMT活性范围,并对所测TPMT值低于活性参考范围下限及在下限附近的患者仍进行随后的电话随访。为建立本实验室的TPMT活性参考范围仍需扩大样本进一步研究。