周期联合甲氨蝶呤、来氟米特和环磷酰胺对大鼠胶原诱导性关节炎滑膜CyclinD1表达作用的研究

摘要

[背景]类风湿关节炎(RA)是一种慢性侵蚀性多关节炎为主要表现的系统性自身免疫性疾病。改变病情抗风湿药物(DMARDs)的联合治疗至今仍然是RA治疗的主流。我们通过10余年的临床及基础研究，已证实联合细胞周期特异性药物甲氨蝶呤(MTX)和周期非特异性药物环磷酰胺(CTX)疗效显著，明显降低了副作用。但RA发病机制尚未完全阐明，新近发现RA滑膜过度增殖与细胞周期调控基因异常表达相关。而细胞周期蛋白在RA发病研究中是一个崭新的细领域。其中cyclinD1研究最多，在正常组织中cyclinD1不表达或表达较低，而在肿瘤组织中常有基因扩增、基因重排及突变，导致表达产物增多，RA滑膜过度增殖是否也与cyclinD1mRNA高表达有关？DMARDs的联合治疗在下调滑膜cyclin D1 mRNA的表达上是否有协同作用？故本课题开展了RA动物模型的实验研究，从cyclinD1角度探讨联合用药的协同效应。 [目的] 通过对RA动物模型大鼠胶原诱导性关节炎（CIA）的实验研究，从cyclinD1角度，研究周期联合免疫抑制剂甲氨蝶呤(MTX)、来氟米特(LEF)和环磷酰胺(CTX)的协同效应和作用机制。 [方法] 建立Ⅱ型胶原诱导的雌性SD大鼠CIA模型。随机分为正常对照组、CIA模型对照组、MTX治疗组(0.9mg.kg-1.w-1)、LEF治疗组(1.2mg.kg-1.d-1)、CTX治疗组(24mg.kg-1.3w-1)、MTX联合CTX治疗组(MTX:0.9mg.kg-1.w-1+CTX:24mg.kg-1.3w-1)、LEF联合CTX治疗组(LEF:1.2mg.kg-1.d-1+CTX:24mg.kg-1.3w-1)、MTX联合LEF治疗组(MTX:0.9mg.kg-1.w-1+LEF:1.2mg.kg-1.d-1)。进行9周体内实验，初次免疫后3周开始给药。治疗过程中连续对大鼠的关节炎症程度进行评分，测量右踝关节直径，计算关节炎指数。治疗6周后全部动物处死取材，再经固定、脱钙、包埋，制成切片，然后各组大鼠行HE染色观察踝关节滑膜组织病理学改变，进行评分。进一步通过原位杂交法检测滑膜cyclinD1mRNA表达水平。其结果用灰度值表示。比较各组灰度值。 [结果] 1.CIA大鼠造模成功率达92.3％(72/78)。症状、影像学、病理评估证实造模成功，为慢性关节炎。 2.关节炎指数(AI):各治疗组AI均较模型组明显改善(P＜0.05);各组AI改善程度MTX联合CTX组＞LEF联合CTX组＞MTX联合LEF组＞MTX组＞LEF组＞CTX组;联合组AI改善程度均优于单药组(P＜0.05);联合组中，MTX联合CTX组、LEF联合CTX组AI改善程度均优于MTX联合LEF组(P＜0.05);单药组间无显著差异。 3.X-ray摄片:各治疗组X线改变均较模型组为轻，联合治疗组X线疗效佳，均优于单药组，各联合治疗组之间及各单药组之间无显著差别。 4.HE关节病理改变:CIA模型组大鼠的滑膜层次增多，可达6-8层，排列紊乱，大量炎性细胞浸润，软骨、骨组织严重侵蚀;MTX联合LEF组、MTX、LEF、CTX组在滑膜炎症、软骨及骨组织侵蚀的改善程度上依次减低，各组间无显著差异;MTX联合CTX组、LEF联合CTX组滑膜炎症、软骨及骨组织侵蚀改善程度较MTX联合LEF组、MTX、LEF、CTX组显著(P＜0.05)。 5.滑膜细胞周期蛋白 1)原位杂交检测滑膜cyclin D1 mRNA结果（分子水平）:CIA模型组大鼠关节滑膜的cyclin D1mRNA阳性染色强度明显高于正常对照组(P＜0.01)。 2)经治疗9周，与CIA组比较，各治疗组滑膜cyclin D1 mRNA均下调，但未恢复至正常对照水平(P＜0.05):MTX联合CTX组＞LEF联合CTX组＞LEF联合MTX组＞ MTX组＞LEF组＞CTX组。 MTX联合CTX组、LEF联合CTX组较MTX联合LEF组、各单药组显著(P＜0.05);MTX联合LEF组、单药组两两间均无显著差异。 3)通过析因设计方差分析，MTX与CTX; LEF与CTX均存在交互作用。MTX与CTX; LEF与CTX治疗组平均灰度值最高，对滑膜细胞滑膜cyclin D1mRNA表达抑制最多，提示MTX与CTX联合治疗;LEF与CTX联合治疗均存在协同效应。 [结论] 1.在CIA大鼠模型中，滑膜cyclin D1mRNA表达上调，可导致滑膜异常增殖。 2.联合治疗组改善关节炎症状均优于各单药组。 3.MTX联合CTX组、LEF联合CTX组在改善滑膜病理改变均优于LEF联合MTX组、MTX、 LEF、CTX组。 4.MTX与CTX; LEF与CTX均存在交互作用，提示MTX与CTX联合治疗;LEF与CTX联合治疗均存在协同效应。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

技术路线

第一部分 胶原诱导关节炎动物模型的建立

材料与方法

结果

结论

讨论

第二部分 周期联合MTX和CTX治疗的治疗效率及作用机制

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新点

附图

参考文献

综述 Cyclin D1对类风湿关节炎滑膜影响的研究进展

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