周期联合甲氨蝶呤、来氟米特和环磷酰胺对大鼠胶原诱导性关节炎P-糖蛋白表达及逆转的研究

摘要

背景：
　　 类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性侵蚀性多关节炎为主要表现的系统性自身免疫性疾病。改变病情抗风湿药(disease modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)联合治疗是治疗RA的重要策略，然而在DMARDs治疗过程中的一个重要现象是药物疗效逐渐减弱，细胞的耐药性起着重要的作用。耐药性研究在肿瘤和抗感染治疗中研究较多，在RA的治疗中是一个新的领域，开始受到关注。其中研究相对较多的是P—糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)介导的多药耐药。我们通过10余年的临床及基础研究已证实周期特异性药物甲氨蝶呤（methotrexateMTX）、来氟米特(leflunomide LEF)和周期非特异性药物环磷酰胺（cyclophosphamide CTX）有协同效应。本课题开展了RA动物模型的实验研究，从耐药分子P-gp的角度进行协同效应机制的研究，周期特异性药物甲氨蝶呤(MTX)和周期非特异性药物环磷酰胺(CTX)对抑制P-gp是否存在协同效应，逆转耐药分子P-gp的表达，克服耐药性，从而克服单一用药的平台期；来氟米特(LEF)主要作用机制可逆性抑制乳酸脱氢酶，从而抑制嘧啶核苷酸从头合成途径，从细胞增殖周期的角度，是周期特异性药物，影响细胞增殖的DNA合成S期，LEF和周期非特异性药物环磷酰胺(CTX)二者联合是否也存在协同效应，可否逆转耐药分子P-gp的表达。同时把周期特异性药物与周期非特异性药物MTX+CTX、LEF+CTX的联合与周期特异性药物MTX+LEF予以比较，进行研究。
　　 目的：
　　 通过对RA动物模型大鼠胶原诱导性关节炎（CIA）的实验研究，从关节炎指数、滑膜病理和脾淋巴细胞P-gp的表达，探讨周期联合免疫抑制剂甲氨蝶呤(MTX)、来氟米特(LEF)和环磷酰胺(CTX)的协同效应和作用机制，探寻影响CIA大鼠脾淋巴细胞P-gp表达的相关因素。
　　 方法：
　　 建立Ⅱ型胶原诱导的雌性SD大鼠CIA模型，随机分为正常对照组、CIA模型对照组、MTX治疗组(0.9mg.kg-1.w-1)、CTX间歇治疗组(24mg.kg-1.3w-I)、LEF治疗组(1.2mg.kg-1.d-1)联合治疗组（两两联合MTX:0.9mg.kg-1.w-I、CTX:24mg.kg-1.3w-1、LEF:1.2mg.kg-1.d-1）。进行9周体内实验，初次免疫后3周开始给药。治疗过程中连续对大鼠的关节炎症程度进行评分，游标卡尺测量右后肢的足肿胀度。治疗6周后全部动物处死取材，再经固定、脱钙、包埋，制成切片。然后各组大鼠行HE染色观察踝关节滑膜的组织病理学改变，进一步通过流式细胞仪测定各治疗组脾脏淋巴细胞P-gp的表达，其表达情况用平均荧光强度(RFI)值表示。结果比较各组间RFI值。
　　 结果：
　　 1.CIA大鼠造模成功率达92.3％(72/78)。症状、影像学、病理评估证实造模成功，为慢性关节炎。
　　 2.关节炎指数（AI）:各治疗组AI均较模型组明显改善，MTX联合CTX治疗组、LEF联合CTX治疗组、MTX联合LEF治疗组关节炎指数均优于MTX组、LEF组、CTX组(P<0.05)；联合治疗组中，MTX联合CTX治疗组、LEF联合CTX治疗组关节炎指数均较MTX联合LEF治疗组显著(P<0.05):单药组中，MTX疗效最佳，LEF疗效次之，CTX疗效较差，各组间无显著差异。
　　 3.X-ray摄片:各治疗组X线改变均较模型组为轻，各单药组之间无差别，联合治疗组优于单药组，MTX联合CTX治疗组、LEF联合CTX治疗组X线改变最小。
　　 4.HE关节病理改变:CIA模型组大鼠的滑膜层次增多，可达6-8层，甚至10余层，排列紊乱，大量炎性细胞浸润，软骨、骨组织严重侵蚀；MTX联合LEF治疗组、MTX、LEF、CTX治疗组滑膜炎症软骨及骨组织侵蚀有所减轻，各组间无显著差异；MTX联合CTX治疗组、LEF联合CTX治疗组滑膜炎症、软骨及骨组织侵蚀改善较MTX联合LEF治疗组、MTX、LEF、CTX治疗组显著(P<0.05)。
　　 5.CIA大鼠脾血淋巴细胞P-gp表达的疾病相关因素:CIA大鼠脾脏淋巴细胞P-gp的表达与足肿胀度(r=0.723P　　 6.CIA大鼠脾淋巴细胞的P-gp表达:流式细胞术检测各组脾脏淋巴细胞P-gp表达的平均荧光强度。CIA模型组大鼠脾脏淋巴细胞的P-gp表达的平均荧光强度高于正常对照组，各治疗组P-gp表达下调，与CIA组比较，对P-gp表达下调中:MTX联合CTX治疗>LEF联合CTX治疗>LEF联合MTX治疗>CTX治疗>MTX治疗>LEF治疗。联合治疗组P-gp表达被显著抑制，均较单药组显著(P<0.05)；联合治疗组间无显著差异(P>0.05)；单药组间无显著差异(P>0.05)，单药各组间与模型组P-gp表达差异无统计学意义(P>0.05)。通过析因设计方差分析，MTX与CTX存在交互作用（F=6.001PO.05)、LEF与CTX无交互作用(F=l.625P>O.05)，提示MTX联合CTX为协同作用。
　　 结论：
　　 1.CIA大鼠脾淋巴细胞P-gp的表达和疾病活动平行，其表达可能与DMARDs疗效下降有关；
　　 2.各用药组均可减少P-gp的表达，逆转耐药。联合治疗组在降低P-gp的表达上均优于单用药治疗组，各联合组间及各单用药组间无差异，MTX与CTX有交互作用，LEF与CTX、MTX与LEF没有交互作用，提示MTX联合和CTX为协同效应。

目录

声明

缩略词表

前言

技术路线:

第一部分 胶原诱导关节炎动物模型的建立

材料与方法

结果

结论

第二部分 周期联合MTX、LEF和CTX治疗CIA大鼠疗效比较以及对P-糖蛋白表达及逆转的影响

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述

个人简介

致谢