NALP3-siRNA对缺氧/复氧诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡的保护作用及其机制

摘要

目的：观察缺氧/复氧对大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)的损伤以及对胞内模式识别受体NALP3蛋白表达的影响。并通过构建NALP3-siRNA抑制大鼠肾小管上皮细胞NALP3的表达，探讨其对缺氧/复氧诱导细胞凋亡的保护作用及其机制。
　　 方法：(1)利用三气培养箱调整氮气压力条件形成缺氧条件，缺氧1h，分别复氧1h、2h、4h、8h、16、24h后收集细胞和培养上清液。胎盘蓝摄取法进行活细胞计数，并检测培养上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)含量以及细胞NALP3蛋白的表达。(2)根据大鼠NALP3全长基因序列设计并合成NALP3-si-RNA质粒，转染大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)，以无关siRNA转染组作为对照。用Western印迹法检测转染细胞NALP3蛋白的表达。(3)将细胞分为正常对照组、H/R组、无关siRNA转染组和NALP3-siRNA转染组。利用三气培养箱调整氮气压力形成缺氧条件，缺氧1h复氧4h后检测培养液上清LDH的含量和细胞NALP3蛋白的表达。(4)采用AnnexinV/IP染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡率；Western印迹法检测细胞IκB-α、Bax和Bcl-2蛋白的表达；EMSA检测NF-κBDNA结合活性。
　　 结果：(1)与对照组相比，NRK-52E缺氧/复氧后LDH升高(p＜0.05)，活细胞计数和细胞存活率较对照组显著下降(p＜0.05)，细胞NALP3表达逐渐增加，在复氧4h达到高峰。(2)特异性NALP3-siRNA能有效抑制NRK-52E的NALP3表达，与无关siRNA转染组相比，NALP3-siRNA转染组NALP3蛋白表达水平明显下调(p＜0.05)。(3)经缺氧复氧后，NRK-52E细胞培养上清液中LDH含量和NALP3蛋白表达表达显著增加。与无关siRNA相比，LDH含量和NALP3的表达有显著下降(P＜0.05)。(4)与对照组相比，H/R后细胞IκB-α磷酸化和降解以及NF-κBDNA结合活性增加，细胞NALP3、Bcl-2和Bax蛋白的表达明显上调，而NALP3-siRNA转染组细胞IκB-α蛋白的降解，NF-κBDNA结合活性以及Bax/Bcl-2蛋白的比值均低于无关siRNA转染组（均P＜0.05）。同时，与对照组相比各组细胞凋亡率明显增多，其中NALP3-siRNA转染组细胞凋亡率明显低于无关siRNA转染组（均P＜0.05）。
　　 结论：H/R使肾小管上皮细胞内NALP3蛋白表达明显上调。NALP3-si-RNA能够显著抑制肾小管上皮细胞内NALP3的表达，对肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤有一定的保护作用。其机制可能通过抑制NALP3表达，对NF-κB的活化以及Bcl-2和Bax蛋白表达的不同调控，减少细胞的凋亡。

目录

声明

摘要

主要缩略词表

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1.缺氧复氧对肾小管上皮细胞的影响

2.缺氧复氧对肾小管上皮细胞NALP3蛋白表达的影响:

3.NALP3-siRNA对NRK-52E细胞NALP3表达的抑制作用：

4.NALP3-siRNA对H/R诱导NRK-52E细胞损伤的作用:

5.各组NRK-52E细胞凋亡情况:

6.NALP3-siRNA对NRK-52E细胞IκB-α降解的影响:

7.NALP3-siRNA对NRK-52E细胞NF-κ B DNA结合活性的影响:

8.NALP3-siRNA对NRK-52E细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的影响:

讨论

结论

参考文献

综述

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