骏枣内生细菌的分离、鉴定与拮抗菌的筛选

摘要

目的：
　　 本研究以交城骏枣为实验材料，用传统分离培养和克隆文库构建的方法研究交城骏枣内生细菌种群多样性;找出一组较适合应用于植物内生细菌分离的培养基;并筛选出能够拮抗多种植物病原菌和人体致病菌的内生细菌。
　　 方法：
　　 1、培养基的选择:对分离内生细菌的常用培养基，如胰酶大豆琼脂培养基(TSA)、任氏培养基(R2A)、金氏培养基B(KMB)、肉汁胨培养基(BPA)、LB培养基、酵母膏蛋白胨琼脂培养基(YPM)、无氮培养基进行选择，以使其能最大限度的分离大枣中的内生细菌。
　　 2、内生细菌的分离及鉴定:采用传统培养方法分离出红枣的内生细菌，并对其形态特征和主要生理生化特性，如接触酶、氧化酶、淀粉水解、硝酸盐还原、吲哚反应、V-P实验、耐盐性、最高耐受温度等进行测定。通过16SrDNA序列测定结果结合生理生化特征对内生细菌做出初步鉴定。
　　 3、拮抗菌的筛选:采用平板对峙法筛选出多种对植物病原菌和人体致病菌有抑菌活性的内生细菌。
　　 4、克隆文库的方法研究成熟健康大枣内生细菌的多样性:①表面灭菌;②大枣基因组DNA的提取;③PCR扩增并切胶纯化;④克隆建库;⑤酶切分型;⑥代表条带的测序;⑦多样性分析。
　　 结果：
　　 1、将大枣组织稀释到104-106倍较适合内生菌的分离，本实验选择的7种分离培养基中KMB培养基和无氮培养基分离内生菌的效果最好。
　　 2、采用传统培养方法从红枣中分离到16株内生细菌和2株内生真菌，经初步鉴定，细菌包括芽孢杆菌（Bacillussp.）、Lysinibacillus菌（Lysinibacillussp.）、葡萄球菌(Staphylococcussp.)、多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）、红球菌(Rhodococcussp.)、库克菌(Kocuriasp.)、节杆菌(Arthrobactersp.)、微球菌（Micrococcussp.）、不动杆菌(Acinetobactersp.)。
　　 3、通过对峙实验从红枣内生细菌中筛选出5株对多种植物病原真菌和人体致病菌有拮抗作用的细菌，分别为不动杆菌(Acinetobactersp.)、节杆菌(Arthrobactersp.)、Lysinibacillus菌（Lysinibacillussp.）、多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）。
　　 4、构建克隆文库，得到阳性克隆151个，划分为15个OTUs（操作分类单元），经过16SrDNA片段测序，有42个克隆属于大肠杆菌(E.coli)，代表了3个OTUs，在该文库中占总克隆数的27.8％。有28个克隆属于蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)，代表了2个OTUs，在该文库中占总克隆数的18.5%。有23个克隆属于类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)，代表了3个OTUs，在该文库中占总克隆数的15.2%。这三个类属于该克隆文库的优势种群。
　　 结论：
　　 1、红枣内分布有大量内生细菌，可培养的菌落数达18株。
　　 2、研究发现，KMB培养基和无氮培养基分离内生细菌的效果最好。
　　 3、分离到的内生细菌中，部分细菌对植物病原真菌和人体的致病菌具有拮抗活性。
　　 4、非培养方法与培养方法得到的种群分布有较大差异。