MicroRNA-200c靶向抑制转录因子AP-2α表达增强结肠癌细胞增殖能力

摘要

研究背景：
　　大肠癌(colorectalcarcinoma)是严重威胁人类生存的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率在世界居恶性肿瘤的第3位，在我国居第4位。据统计，自1975年以来，结直肠癌发生率呈一个逐年上升的趋势。经临床研究发现，大肠癌的5年存活率较低。因此，早期发现、诊断与治疗是提高大肠癌患者生存率的关键。但由于传统治疗方法的特异性、敏感性差，致使治疗效果欠佳。因此，结直肠癌发生发展过程中涉及的多数基因的分子作用机制仍然有待于更深入地研究，从而对于临床结直肠癌的诊断、治疗及预后都有重要的指导意义。
　　转录因子AP-2α(Transcriptionfactoractivatorprotein-2，AP-2α)是一种细胞特异的DNA结合蛋白，具有独特的蛋白质分子结构。人们已经发现在多种肿瘤中，如乳腺癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、神经胶质瘤以及结直肠癌,发现有AP-2α表达的降低或者缺失，提示AP-2α可能具有肿瘤抑制基因的作用。同时研究发现Duke’s分期与病理分级较高的病人结肠癌组织中AP-2α的表达降低或缺失，而且AP-2α的mRNA和蛋白的表达水平不一致，提示可能是某种转录后调控机制发生异常。
　　微小RNA（microRNAs,miRNAs）是一类具有转录后水平基因表达调控作用的非编码小分子RNA，通过与大量靶基因的3'UTR区特异性结合，直接相互作用，在转录后水平控制靶基因的表达。研究发现在人类结肠癌中mir-200c呈高表达的状态，且与结肠癌病人的预后有直接关系。但mir-200c对人类结肠癌的影响及其作用机制研究仍不十分透彻。通过Targetscan与microRNA.org两个生物信息学数据库筛选预测miR-200c可能的靶向作用的目的基因中均有AP-2α。所以我们猜想miR-200c可能通过抑制AP-2α的表达从而影响结肠癌细胞的增殖能力。
　　目的：
　　1.观察miR-200c和AP-2α在正常结肠上皮组织和结肠癌细胞中的表达并构建hsa-miR-200c真核表达质粒PEZX-miR-200c和特异抑制剂miR-200c-inhibitor。
　　2.观察miR-200c过表达对结肠癌HCT-116细胞增殖与凋亡能力的影响以及抑制miR-200c后对结肠癌SW480细胞增殖与凋亡能力的影响。
　　3.观察hsa-miR-200c对结肠癌HCT-116细胞中AP-2α基因的表达的抑制作用以及hsa-miR-200c-inhibitor对结肠癌SW480细胞中AP-2α基因的表达的诱导作用并初步分析其发挥作用的可能分子机制。
　　方法：
　　1.利用生物信息学数据库筛选预测可能与转录因子AP-2α特异性结合的microRNA并合成其真核表达质粒与特异干扰序列。
　　2.在脂质体介导下将真核表达质粒PEZX-mir-200c和对照质粒PEZX-NC分别转染人结肠癌细胞株HCT-116中，即HCT-116/PEZX-mir-200c组（HCT-116过表达组）和HCT-116/PEZX-mir-NC组（HCT-116对照组），分别用CCK-8实验检测各组细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞凋亡情况和细胞周期检测法检测细胞周期分布情况。将特异抑制剂miR-200c-inhibitor和对照抑制剂miR-67-inhibitor分别转染入结肠癌细胞株SW480中，即SW480/miR-200c-inhibitor（SW480干扰组）和SW480/miR-67-inhibitor（SW480对照组），用同样方法检测各组细胞增殖能力、增殖能力和细胞周期分布情况。
　　3.提取正常结肠上皮组织、HCT-116细胞、SW480细胞、HCT-116过表达组、HCT-116对照组、SW480干扰组和SW480对照组总RNA，应用荧光实时定量PCR技术检测AP-2αmRNA表达水平;提取HCT-116细胞、SW480细胞、HCT-116过表达组、HCT-116对照组、SW480干扰组和SW480对照组总蛋白，用Westernblotting技术检测AP-2α蛋白表达水平；HCT-116过表达组、HCT-116对照组、SW480干扰组和SW480对照组细胞爬片后进行免疫细胞化学染色检测AP-2α蛋白质表达情况。
　　4.HEK-293T细胞中，分别共转染PEZX-mir-200c与pmirGLO-AP-2α-3'UTR（实验组）与共转染PEZX-mir-200c与pmirGLO-AP-2α-3'UTR-deleted（对照组），用双荧光素酶报告基因测定试剂法检测酶活性，判断miR-200c是否与AP-2α3'UTR特异性结合。
　　结果：
　　1.利用Targetscan与microRNA.org两个生物信息学数据库成功筛选预测出hsa-miR-200c可能与AP-2α3'UTR特异性结合，并成功构建miR-200c的真核表达质粒PEZX-mir-200c和miR-200c特异抑制剂miR-200c-inhibitor。
　　2.细胞增殖实验的研究发现，HCT-116过表达组细胞增殖能力增强；SW480干扰组细胞增殖能力明显减弱。细胞周期分布实验显示，SW480干扰组sub-G1期百分数为78％±0.7%而SW480对照组与SW480未处理组分别为66%±1.1%和64%±1.4%。说明miR-200c促进细胞增殖且干扰miR-200c使停滞在sub-G1期细胞比率增加。经流式细胞术检测发现，干扰miR-200c72h后，SW480细胞凋亡率增加，其凋亡率为44.31%±2.1%，而阴性对照组细胞与未处理组细胞的凋亡率分别为为34.48%±1.99%与26.11%±1.07%；说明干扰miR-200c可能通过诱导AP-2α的表达促进大肠癌细胞凋亡增加。
　　3.荧光实时定量PCR结果显示两种结肠癌细胞株HCT-116与SW480中miR-200c相对表达值分别为5.85±0.67与6.62±0.53，均显著高于正常结肠癌组织。HCT-116过表达组中AP-2αRNA相对表达值为0.67±0.07。SW480干扰组中AP-2αRNA相对表达值为0.98±0.05。转染PEZX-mir-200c后，可以抑制HCT-116细胞中AP-2αRNA的表达，而转染miR-200c-inhibitor后，SW480细胞中AP-2αRNA的表达无显著变化。HCT-116过表达组中AP-2α蛋白表达的相对灰度值分别为(0.51±0.09)，HCT-116对照组中为(0.73±0.07);免疫细胞化学染色灰度值分别为116.2±14.9和72.6±15.3。SW480干扰组中AP-2α蛋白表达的相对灰度值为(1.98±0.07)，SW480对照组中为(1.17±0.09)；免疫细胞化学染色灰度值分别为121.0±24.6和185.6±16.8。miR-200c可以抑制HCT-116细胞中AP-2α蛋白的表达而miR-200c-inhibitor使SW480细胞中AP-2α蛋白表达增加。
　　4.双荧光素酶报告基因测定法结果显示，实验组的相对荧光素酶活性值为0.51±0.09，对照组值为0.98±0.04，未处理组值为1。说明miR-200c与AP-2α3'UTR特异性结合。
　　结论：
　　成功转染miR-200c过表达质粒，可以增强人结肠癌HCT-116细胞体外恶性增殖能力；成功干扰miR-200c后有效抑制人结肠癌SW480细胞体外恶性增殖能力并诱导其凋亡。其作用机制与miR-200c抑制AP-2α转录后水平的表达活性进而影响细胞活性有关，本研究为结肠癌基因治疗提供新的思路和方法。

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中文摘要

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插图、附表清单

主要英文缩略语表

前 言

第一章 材 料 与 方 法

1 实验材料

2 实验方法

第二章 实 验 结 果

1 人正常结肠上皮组织与结肠癌细胞中hsa-miR-200c与AP-2α的表达

2 重组质粒测序鉴定及转染效果

3 转染PEZX-miR-200c或miR-200c-inhibitor后对大肠癌细胞增殖能力的影响

4 转染miR-200c-inhibitor后对大肠癌细胞SW480凋亡能力的影响

5 转染miR-200c-inhibitor后对大肠癌SW480细胞周期的影响

6 转染PEZX-miR-200c或miR-200c-inhibitor后AP-2α在大肠癌细胞中的表达

7 双荧光素酶报告基因分析法验证 miR-200c与AP-2α3’UTR区特异性结合

第三章 讨 论

第四章 结 论

参考文献

综 述

攻读学位期间发表文章情况

致谢

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