TLR3在HBsAg阳性母亲新生儿乙肝疫苗无/低应答中的作用机制研究

摘要

目的:
　　 ①了解HBsAg阳性母亲新生儿脐血单个核细胞(CBMCs)表面Toll样受体3(TLR3)与乙肝疫苗无/低应答的关系。
　　 ②探讨HBsAg阳性母亲新生儿脐静脉血CBMCs中相关免疫细胞与乙肝疫苗无/低应答的关系。
　　 ③探索TLR3在HBsAg阳性母亲新生儿乙肝疫苗(HepB)无/低应答中可能的作用机制。
　　 方法:
　　 ①收集2011年7月-2012年5月于太原市第三人民医院妇产科分娩的HBsAg阳性母亲及其新生儿41对。采集新生儿出生时30mL脐血及3mL股静脉血。采用面对面问卷调查方法收集母儿的流行病学资料。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)及实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测母亲及其新生儿出生24小时内外周血乙肝病毒标志物及HBV DNA含量。
　　 ②新生儿按照0，1，6程序完成乙肝疫苗全程免疫后，于新生儿12±1个月龄时采集其股静脉血5ml，采用化学发光法检测其血清中抗-HBs含量，了解HBsAg阳性母亲新生儿乙肝疫苗无/低应答率。
　　 ③采用密度梯度离心法分离新生儿脐静脉血CBMCs，乙肝疫苗无/低应答组和高应答组均分为三组进行体外细胞培养，包括HBV(-)对照组、细胞培养24h、48h分别用PolyI∶C、HBV刺激活化CBMCs的PolyI∶C+HBV(+)刺激组、培养48h后仅用HBV进行刺激的HBV(+)刺激组。且于HBV刺激72小时后收集细胞。
　　 ④采用多色流式细胞术(FCM)检测两组TLR3的蛋白表达水平以及DCs、T细胞、CD4+CD25+Treg和B细胞的百分比。
　　 结果:
　　 ①HepB高应答组CBMCs细胞经HBV以及PolyI∶C+HBV刺激后TLR3蛋白水平均低于HBV(-)组;HepB无/低应答HBV感染组与HBV(-)组相比，TLR3蛋白水平较低，经PolyI∶C刺激后，无/低应答组CBMCs细胞表面TLR3蛋白含量高于HBV(+)组。CBMCs经HBV和PolyI∶C+HBV刺激后，细胞表面TLR3蛋白含量在HepB高应答组与无/低应答组之间差异无统计学意义(t=0.94，P=0.35; t=0.23, P=0.81)。
　　 ②HepB高应答组经HBV以及PolyI∶C+HBV刺激后mDC与pDC的比值均高于HBV(-)组;HepB无/低应答HBV(+)组mDC与pDC比值低于HBV(-)，但高于PolyI∶C+HBV(+)组。CBMCs经HBV和PolyI∶C+HBV刺激后，mDC与pDC的比值在HepB高应答组与无/低应答组之间差异无统计学意义(t=0.27,P=0.78;t=0.33, P=0.78)。
　　 ③HepB高应答组经HBV以及PolyI∶C+HBV刺激后CD4+T细胞与CD8+T细胞比值低于对照组;HepB无/低应答HBV(+)组CD4+T/CD8+T比值高于HBV(-)组和PolyI∶C+HBV(+)组。乙肝疫苗高应答组与无/低应答组CBMCs经HBV及PolyI∶C+HBV刺激活化后，两组CD4+T与CD8+T细胞比值差异无统计学意义(t=0.54, P=0.58; t=0.40, P=0.68)。
　　 ④HepB高应答组经HBV以及PolyI∶C+HBV刺激后Treg细胞百分比均低于HBV(-)组;HepB无/低应答HBV(+)组Treg细胞百分比高于HBV(-)组和PolyI∶C+HBV(+)组。乙肝疫苗高应答组与无/低应答组CBMCs经HBV及PolyI∶C+HBV刺激活化后，两组CD4+CD25+Treg细胞百分比差异无统计学意义(t=0.29, P=0.77; t=0.10, P=0.92)。
　　 ⑤HepB高应答组经HBV以及PolyI∶C+HBV刺激后B细胞百分比低于HBV(-)组;HepB无/低应答组HBV(+)组B细胞百分比高于HBV(-)组和PolyI∶C+HBV(+)组。乙肝疫苗高应答组与无/低应答组CBMCs经HBV刺激后，两组B细胞百分比差异无统计学意义(t=0.12，P=0.87)。而经PolyI∶C+HBV刺激活化，两组B细胞百分比差异有统计学意义(t=1.78，P=0.01)。
　　 结论:
　　 ①乙肝疫苗无/低应答对照组的TLR3蛋白略低于高应答组，在经PolyI∶C刺激后其表达水平略高于高应答组，提示PolyI∶C可作为TLR3配体提高无/低应答者CBMCs细胞表面的TLR3受体水平。
　　 ②经PolyI∶C刺激后乙肝疫苗无/低应答者CBMCs细胞表面TLR3蛋白表达水平略高于HBV(+)组，且mDC与pDC的比值、CD4+T/CD8+T的比值、Treg细胞百分比均低于HBV(+)组，而B细胞的百分比未随TLR3蛋白含量的变化而改变，提示新生儿TLR3蛋白表达与启动HepB无/低应答的细胞免疫应答有关。

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摘要

常用缩写词中英文对照表

前言

第一章 TLR3在HBsAg阳性母亲新生儿乙肝疫苗无／低应答中的作用

1 对象及方法

2 结果

3 讨论

第二章 HBsAg阳性母亲新生儿CBMCs中相关免疫细胞与乙肝疫苗无／低应答的关系

1 对象及方法

2 结果

3 讨论

小结

研究特色

参考文献

综述

个人简历

致谢