不同来源阿萨希毛孢子菌体外药敏及氟康唑耐药诱导研究

摘要

研究背景:
　　 近30年来，随着激素和免疫抑制剂的应用，恶性肿瘤、大面积烧伤、器官移植、血液病、艾滋病患者日益增多，条件性致病真菌感染的发病率呈显著上升趋势，已成为这些患者死亡的主要原因之一。近20年来，除了白念珠菌、烟曲霉、隐球菌等常见致病真菌外，另一个重要致病真菌——阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii,T.asahii的感染率呈逐年上升趋势。T.asahii也是一种条件性致病真菌，广泛存在于自然环境和定植于人体的部分组织器官中。它可通过内置导管、引流管、烧伤患者破损的皮肤、肠黏膜微生物易位及呼吸道吸入等多种途径致病，导致皮肤浅表感染、夏季超敏性肺炎以及内脏器官的深部感染。免疫抑制、免疫缺陷及免疫低下宿主是T.asahii感染的主要易感人群，但是，近些年在免疫正常人群也不断有该菌播散性感染的报道。目前的研究数据表明:该菌侵袭性感染的死亡率高达80～90％。
　　 国内外研究已经表明:T.asahii对大多数临床一线抗真菌药如两性霉素B、氟胞嘧啶、卡泊芬净等均耐药，仅对少数抗真菌药如唑类药物——伏立康唑、氟康唑、伊曲康唑等敏感。然而，近10多年来，T.asahii对唑类药物耐药以及唑类药物治疗T.asahii感染失败的报道越来越多，体外药敏试验也发现了不少T.asahii临床分离菌株对氟康唑不敏感。T.asahii对唑类药物产生耐药使该菌感染的治疗及防控变得更加棘手。因此，T.asahii的唑类药物耐药机制研究显得非常重要、十分迫切。目前T.asahii的唑类药物耐药机制尚不清楚，而获得耐药菌株是研究耐药机制的前提与基础。目前获得耐药株的途径主要是通过临床分离及实验室体外诱导。临床分离耐药株受多种因素影响，较难获得，且更难获得同一菌株的敏感母本及耐药子代，影响了研究的可靠性。实验室体外诱导获得耐药株的方法具有操控性好、易于获得与敏感母本基因型相同的耐药予代等优点，在其他真菌的耐药机制研究中已得到广泛应用。
　　 既往T.asahii的研究主要集中于临床分离株，目前尚无对不同分离来源的环境株与临床株的体外药物敏感性进行研究以及关于T.asahii抗真菌药体外诱导耐药株的报道。本研究首先对不同分离来源的T.asahii进行体外药物敏感性试验，筛选出临床株和环境株中的敏感菌株，然后用氟康唑以浓度梯级倍增的方法将筛选出来的临床敏感菌株及环境敏感菌株分别在体外进行诱导，获得耐药子代菌株，再进行耐药子代菌株的回复性研究，观察它们的耐药稳定性，为下一步研究T.asahii的耐药机制奠定基础。
　　 研究目的:
　　 观察不同分离来源的T.asahii对6种常见抗真菌药物体外敏感性的差异，筛选出临床株和环境株中对氟康唑敏感的菌株;用氟康唑将敏感菌株在体外诱导，获得耐药子代菌株，并对耐药子代菌株进行回复性研究，观察它们耐药稳定性。
　　 研究方法:
　　 1.以我中心保藏的12株不同分离来源的T.asahii为研究对象，选用PDA培养基上37℃生长24h的菌落，在90mmRPMI真菌药敏平板上，采用E-test试条测定6种常见抗真菌药物对各菌株的MIC值。筛选出临床分离株及环境分离株中氟康唑MIC值最低的两株菌;
　　 2.将筛选出的两株敏感菌株，在含氟康唑浓度梯级倍增的PDA固体培养基中分别传代培养，每次转种前均用E-test法测定氟康唑对其的MIC值，直至其MIC值＞256μg/ml;
　　 3.将诱导后氟康唑MIC值＞256μg/ml的耐药子代菌株，分别在不含氟康唑的PDA培养基中连续传代，培养18天，并监测每代菌株的MIC值，观察它们的耐药稳定性。
　　 结果:
　　 1.氟胞嘧啶及阿尼芬净对12株不同来源的T.asahii均无体外活性，它们的MIC值均大于32μg/ml;两性霉素B对T.asahii活性差且具有不稳定性，多次重复MIC值差异较大，大部分菌株的MIC值大于32μg/ml，其中CBS2479、BZP07005R、BZP09001的MIC值较低且不稳定，分别为0.75μg/ml、1.00μg/ml、1.00μg/ml;唑类抗真菌药对T.asahii有较好的体外活性，特别是伏立康唑最敏感，大部分菌株的MIC值小于0.016μg/ml，最高的MIC值也仅为0.125μg/ml;与临床株相比，环境株对唑类药物更加敏感，所有环境株对伏立康唑的MIC值均小于0.016μg/ml; CBS2479和CBS8904分别是临床及环境分离来源菌株中对氟康唑最敏感菌株;
　　 2.氟康唑MIC值分别为0.25μg/ml及1.5μg/ml的T.asahii敏感株——CBS2479和CBS8904均被成功诱导为氟康唑MIC值＞256μg/ml的耐药子代菌株——CBS2479R/CBS8904R，MIC值（耐药性）分别较诱导前提高了170倍和1024倍;
　　 3.将诱导成功的不同来源耐药子代菌株，分别在不含氟康唑PDA培养基中连续传代18天，CBS2479R的氟康唑MIC值未见下降;CBS8904R氟康唑MIC值逐渐下降，至第18天时降为64μg/ml，较回复前下降了4倍。
　　 结论:
　　 不同分离来源的T.asahii体外药物敏感性对不同抗真菌药有所不同，氟胞嘧啶及阿尼芬净对12株不同来源的T.asahii均无体外活性，两性霉素B对T.asahi活性差且具有不稳定性，伏立康唑对T.asahii最敏感;临床株与环境株之间体外药物敏感性有显著差异，环境分离株的药物敏感性更高一些;氟康唑在体外能将不同来源的、对其敏感的T.asahii成功诱导为具有高度耐药性的子代菌株，且不同来源T.asahii其耐药子代菌株的耐药稳定性不相同，临床株较环境株更稳定。

目录

声明

摘要

前言

技术路线

第一部分 不同来源T．asahii的体外药物敏感性

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分：T．asahii敏感株氟康唑体外耐药诱导与回复研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 常见致病真菌唑类耐药基因研究进展

附录

攻读学位期间发表论文情况

致谢

个人简历