Rattin拮抗Aβ31-35神经毒性作用的行为学、电生理和分子机制研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)即老年性痴呆(senile dementia)，是一种以认知和精神状况改变为主要表现的神经系统退行性疾病，主要临床表现有智力下降、人格改变、进行性学习、记忆和注意力丧失。AD的主要病理学特征为:脑内出现高密度的老年斑（senile plaque，SP）、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)和神经元丧失等。随着社会人口逐渐老龄化，AD发病率也随之增加，严重威胁老年人的健康和生活质量，给社会带来巨大的人力及财力负担。然而，AD的病因和发病机制目前尚无定论，虽然普遍认为老年斑中的主要成分β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）与AD的发病有关，但迄今为止仍缺乏有效清除Aβ或拮抗Aβ神经毒性作用的治疗性药物，攻克AD仍是医学乃至生命科学面临的一项艰巨而紧迫的任务。 Humanin(HN)的发现为AD和其它记忆损伤疾病的治疗开辟了一条新的道路。日本东京KEIO大学医学院的Hashimoto教授及其同事根据AD患者的枕叶在发病过程中完好无损这一现象，推测在AD发病过程中，枕叶的神经元一定启动了某种基因的表达。以此为出发点，通过对从AD患者脑的枕叶提取的cDNA文库的表达进行功能监测，他们于2001年发现了一个编码24肽的基因，并将其命名为Humanin(HN)。离体实验证明，这种多肽能有效、特异地抑制多种FAD基因和Aβ衍生物诱发的神经元的凋亡，因此被称为神经生存肽。目前，HN的作用机制仍不清楚，但这一发现±少为治疗AD带来了新的启示，人们期待通过对该多肽进行修饰，开发出一种具有美好前景的治疗AD的药物。令人欣喜的是，HN除存在于人染色体外，科学家们已在大鼠、小鼠、猴子、线虫等多种动物体内得到HN的对应物质。caricasole等从大鼠的cDNA文库中鉴别出HN的类似碱基片断，编码一条由38个氨基酸残基组成的多肽(C-末端比HN长14个氨基酸残基)，并将其定名为Rattin(RN)。Rattin的发现为利用大鼠模型进行HN实验研究提供了极大便利。本研究在脑内注射Aβ制备AD大鼠模型的基础上，对大鼠特异性的HN衍生物——Rattin的神经保护作用进行了系统的行为学、电生理和分子生物学机制研究，旨在为AD的预防和治疗提供一个新的、有效的策略。 本研究进行了如下三部分工作: (1)鉴于Morris水迷宫是经典的评价动物空间学习和记忆能力的可靠方法，本研究通过Morris水迷宫行为学试验，观察了双侧大鼠海马内注射Rattin对Aβ31-35所致认知功能伤害的有效逆转效应; (2)鉴于AD患者认知功能下降与Aβ伤害突触传递和突触可塑性有关，且海马LTP已被视为学习记忆机制的细胞学模型，本研究利用在体海马CA1区场电位记录手段，在成功诱导兴奋性突触后电位(EPSP)的基础上，观察了Rattin处理对Aβ31-35所致海马LTP压抑的逆转效应; (3)考虑到HN的酪氨酸蛋白激酶机制，本研究以原代培养的大鼠海马神经元为模型，观察了Rattin是否对Aβ31-35片段引起的神经元损伤具有保护作用，并使用Real-time PCR技术观察了酪氨酸蛋白激酶信号通路中MAPK、IP3K和JAK/STAT3三条不同途径在Aβ31-35所致细胞损伤以及Rattin神经保护作用中的贡献，在了解到Rattin可能是通过JAK/STAT3信号通路发挥的神经保护作用后，我们利用流式蛋白定量技术进一步检测了磷酸化STAT3的蛋白表达变化。最后，利用激光共聚焦Ca+荧光成像技术，观察了Rattin是否对Aβ31-35片段引起的钙超载具有预防和拮抗作用，并利用JAK特异性拮抗剂AG490进一步明确了Rattin保护作用的机制。 第一部分、Rattin保护大鼠空间学习和记忆功能免受Aβ31-35片段引起的损伤 目的:为了阐明Rattin在大鼠脑内的神经保护作用，本研究采用了经典的行为学方法---Morris水迷宫技术观察了双侧海马内注射Rattin对Aβ31-35诱导的大鼠空间学习和记忆功能损伤的影响。 方法:选用无视觉和运动障碍的雄性SD大鼠(200-300g)，随机分为对照组、Aβ31-35组、高浓度Rattin组以及不同浓度Rattin和Aβ31-35联合注射组，每组10只。将麻醉后大鼠在脑立体定位仪下，应用微量注射器将Rattin和/或Aβ31-35注入双侧海马内，待动物清醒并恢复两周后，进行Morris水迷宫试验。试验包括定位航行、空间探索和可见平台三部分实验，主要观察药物处理对大鼠逃避潜伏期、游泳距离、大鼠在目标象限（即平台所在象限）游泳所占时间、距离百分比的影响。同时，测定大鼠游泳速度和视力，以排除大鼠的运动和视力障碍对检测指标的影响。 结果: (1) Aβ31-35损伤了大鼠空间学习和记忆功能。首先利用连续五天的定位航行试验评估大鼠获取空间信息的学习能力，第六天撤除水下平台后通过空间探索试验检测大鼠的空间记忆能力。结果显示，随着训练日期的延长，各组大鼠寻找水下隐藏平台的平均逃避潜伏期和距离都逐渐减小。但与对照组相比，Aβ31-35组(n=10)大鼠的空间学习能力明显下降，寻找隐藏平台的逃避潜伏期和距离均延长。在训练的第2-5天平均逃避潜伏期分别为55.32±1.68秒(P＜0.01)，33.54±1.41秒(P＜0.01)，24.17±0.55秒(P＜0.01)，和18.38±0.51秒(P＜0.01)，明显长于对照组(n=10)的28.61±0.99秒，20.61±0.97秒，16.50±0.45秒和14.47±0.52秒。同样，在训练的第2-5天Aβ31-35组大鼠的平均逃避距离延长，分别为685.19±18.68厘米(P＜0.01)，491.34±13.60厘米（P＜0.01），393.80±9.33厘米(P＜0.01)和262.05±6.59厘米(P＜0.01)，明显长于同一时间点对照组的540.11±14.45厘米，349.33±16.30厘米，281.56±13.15厘米和208.92±3.55厘米。空间探索试验中，Aβ31-35组大鼠在目标象限中游泳时间和距离占总时间和总距离的百分比明显减少，分别从对照组的47.63±1.43％和45.09±1.41％下降至29.35±1.09％(P＜0.01)和29.26±1.18％(P＜0.01)。这些结果提示:双侧海马内注射Aβ31-35严重损伤了大鼠的空间学习和记忆功能。 (2) Rattin有效防止了Aβ31-35所致的大鼠空间学习记忆损伤。首先发现，在隐藏平台试验中单独使用即使是高浓度的Rattin(2nmol)都不影响大鼠的逃避潜伏期和距离，目标象限内游泳时间和距离的百分比也没有改变。然而，不同浓度的Rattin(0.02、0.2、2nmol)可以剂量依赖性阻止Aβ31-35所致的空间学习和记忆缺陷。与单独使用Aβ31-35组比较，低浓度Rattin(0.02nmol)+ Aβ31-35组(n=10)没有明显改变大鼠的平均逃避潜伏期和距离。但在0.2nmolRattin+Aβ31-35组(n=10)，训练第2-5天的平均逃避潜伏期分别下降±42.11±0.72秒(P＜0.01)，27.36±0.29秒（P＜0.01），20.18±0.50秒（P＜0.01），和15.48±0.27秒(P＜0.01);平均逃避距离分别下降±626.58±6.52厘米(P＜0.01)，427.67±10.77厘米(P＜0.01)，323.52±4.00厘米(P＜0.01)，和226.01±2.94厘米(P＜0.01)。在2nmol Rattin+Aβ31-35组(n=10)平均逃避潜伏期进一步降±33.15±0.72秒(P＜0.01)，26.10±0.71秒(P＜0.01)，18.66±0.55秒(P＜0.01)和14.92±0.19秒(P＜0.01);平均逃避距离下降±585.26±9.20厘米(P＜0.01)，381.80±6.54厘米(P＜0.01)，306.31±4.34厘米(P＜0.01)和208.52±2.15厘米(P＜0.01)。与低浓度Rattin(0.02nmol)相比，高浓度Rattin（0.2nmol和2nmol）+Aβ31-35组的平均逃避潜伏期和距离明显降低。在空间探索试验中，不同浓度的Rattin预处理剂量依赖性阻止了Aβ31-35所致的记忆缺失，使大鼠在目标区域的游泳总时间和总距离百分比明显增加，其中在0.2nmol和2nmol Rattin组时间百分比分别增加±36.60±1.67％(P＜0.01)和42.71±1.58％(P＜0.01)，显著高于单独使用Aβ31-35组的29.35±1.09％;这两组的距离百分比分别增加±33.99±1.68％(P＜0.05)和39.99±1.81％(P＜0.01)，高于单独使用Aβ31-35组的29.26±1.18％。上述结果提示单独使用Rattin不影响大鼠的空间认知功能，但不同浓度的Rattin预处理可以浓度依赖性防止Aβ31-35所致空间学习和记忆的损伤。 (3)空间探索实验之后进行的可视平台实验显示，各组大鼠逃避潜伏期没有显著差异，到达可视平台的平均时间几乎均为14秒左右。连续5天学习期间，各组大鼠游泳速度也没有统计学差异(P＞0.05)，平均游泳速度约为19cm/s。这些结果提示，Aβ31-35所致空间学习和记忆的损伤和Rattin的保护作用不是由于大鼠的视力和运动能力发生变化引起的。 结论:双侧海马内注射Aβ31-35能够明显损害大鼠的空间学习和记忆能力，Rattin本身对大鼠的学习、记忆能力没有影响，但是可以剂量依赖性地拮抗Aβ31-35引起的大鼠空间学习记忆能力的损伤。提示脑内HN及其衍生物的高表达或使用外源性合成肽有可能对AD认知功能的下降起到一定的预防和治疗作用。 第二部分、Rattin保护在体大鼠海马长时程增强免受Aβ31-35引起的损伤 目的:利用电生理学手段，在大鼠海马记录场兴奋性突触后电位（fieldexcitatory postsynaptic potential，fEPSP）的基础上，观察了双侧海马内注射Aβ31-35和Rattin以及二者联合应用对大鼠海马CA1区在体长时程增强(LTP)的影响，旨在探讨Rattin拮抗Aβ31-35神经毒性作用的电生理学机制。 方法:在Morris水迷宫试验之后，将麻醉大鼠固定在脑立体定位仪上，在三维推进装置的引导下，将绑定的同心圆双极刺激电极和单极记录电极精确插入到大鼠海马内Schaffer侧枝和CA1区。给予高频刺激(high frequencystimulation，HFS)后，在海马CA1区记录fEPSP，观察各种药物对基础fEPSP和LTP的影响。 结果: (1) Aβ31-35抑制了在体大鼠海马CA1区的长时程增强效应。在给予海马内Schaffer侧枝三组高频刺激后，对照组(n=6)的fEPSP平均振幅从最初设定的对照值100％突然增加至187.67±7.24％，并且在高频刺激后一小时仍然维持在150％以上，表明在这种在体实验条件下可成功诱导长时程增强效应。与对照组相比较，注射Aβ31-35(10 nmol，n=6)后明显抑制了海马长时程增强效应。高频刺激后0、15、30、60分钟时，fEPSP平均振幅分别从对照组的187.67±7.24％，167.01±1.66％，161.21±2.31％和150.53±3.01％降±165.96±4.11％(P＜0.01),133.83±3.25％(P＜0.01),126.11±3.94％(P＜0.01)和112.14±1.94％(P＜0.01)。 (2) Rattin注射剂量依赖性地拮抗了Aβ31-35对海马长时程增强效

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CONTENTS

摘要

ABSTRACT

PART Ⅰ The Neuroprotection of Rattin against Neurotoxic Amyloid β Protein in Spatial Learning and Memory of Rats

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

REFERENCES

PART Ⅱ Rattin Protects against Aβ31-35-Induced Impairment of Hippocampal Long Term Potentiation in Rat Hippocampal CA1 Region in vivo

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

REFERENCES

PART Ⅲ Effects of Rattin on Aβ31-35-Induced Neurotoxocity and Molecular Mechanisms in Cultured Primary Rat Hippocampal Neurons

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

REFERENCES

综述 Humanin及其衍生物对阿尔茨海默病的神经保护作用

攻读学位期间发表论文情况

致谢

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