刚地弓形虫滑行相关蛋白45基因的生物信息学分析、克隆表达及重组蛋白的免疫保护性研究

摘要

目的：生物信息学分析刚地弓形虫滑行相关蛋白45（TgGAP45）的基因及蛋白质序列。克隆、表达TgGAP45基因，纯化rTgGAP45并且分析可能具备的抗原性质。观察不同剂量rTgGAP45不同途径免疫小鼠诱导的免疫应答及抵抗弓形虫慢性和致死性感染的能力，为弓形虫疫苗提供理论依据。 方法： 第1部分:对刚地弓形虫TgGAP45的基因序列和蛋白质序列进行生物信息分析，使用生物信息学在线分析流程，如ProtParam、WoLF PSORT、PSORTⅡ等，预测其理化性质、跨膜区、空间结构以及潜在的抗原表位等。 第2部分:根据TgGAP45基因开放阅读框（GenBank: AF453384.1）设计引物，并引入EcoRI和XhoⅠ酶切位点，以RH株刚地弓形虫速殖子反转录的cDNA为模板，PCR扩增编码TgGAP45）的基因片段，扩增产物经双酶切后，连接到原核表达质粒pET30a(+)中，重组质粒被转入大肠埃希菌(E.coli) DH5α中，用菌液PCR、双酶切和基因测序判定阳性克隆;阳性重组质粒pET30a(+)-TgGAP45转染E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达重组蛋白，SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色法检测表达产物。用Ni-NTA层析法纯化rTgGAP45，免疫印迹法鉴定重组蛋白的免疫原性。 第3部分:40只雌性BALB/c小鼠被随机分成4组，分别为30μg蛋白滴鼻免疫组、30μg蛋白皮下注射组、60μg蛋白皮下注射组、20μl PBS滴鼻组，其中滴鼻组和皮下注射组的rTgGAP45分别溶于总体积为20μl和100μl的PBS中。第0、14和21d各滴鼻免疫1次。末次免疫后14d，眼后静脉丛采血，收集血清。无菌取脾并制备单细胞悬液，分别用rTgGAP45、ConA刺激脾淋巴细胞，CCK-8法测定淋巴细胞的增殖指数，收集小肠、鼻咽、阴道冲洗液，并刮取肠黏膜。ELISA测定血清IgG和IgA、3种清洗液中sIgA和脾淋巴细胞培育上清和肠黏膜细胞中IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平。 第4部分:64只雌性BALB/c小鼠随机分为4组，分别为30μg rTgGAP45（溶于20μl PBS）滴鼻组、30μg或60μg rTgGAP45（溶于100μl PBS）皮下注射组，对照组20μl PBS滴鼻，于第0、14和21 d各免疫1次。末次免疫后14d，分别用1×104速殖子（慢性感染，每组6只）或4×104速殖子（致死性感染，每组10只）灌胃攻击每只小鼠。攻击后30 d，处死慢性感染实验组小鼠，分离出肝和脑组织，并计数组织内的速殖子数。攻击后观测和记录致死性感染实验组的小鼠健康状况，计算小鼠的30d存活率。 结果：TgGAP45基因编码蛋白由245个氨基酸组成，分子式C1122H1860N362O409S11，分子质量27317.9，等电点理论值为5.05，半衰期为30 h，不稳定系数为54.3，溶液中性质不稳定。亚细胞定位于细胞内膜中，有4个潜在的抗原表位。 PCR扩增产物的大小738 bp，菌液PCR、双酶切和基因测序结果表明重组质粒pET30a(+)-TgGAP45的载体构建成功。SDS-PAGE结果表明，目的基因TgGAP45在表达菌E.coli BL21中高效表达，相对分子量（Mr）约35 kDa，为可溶性蛋白。免疫印迹(WB)结果表示，该重组蛋白能被抗HIS标签抗体、人抗弓形虫免疫血清所识别。速殖子抗原能被抗重组滑行相关蛋白45所识别。 30μg滴鼻组、30μg和60μg皮下组血清IgG和IgA明显高于对照组且差异有统计学意义，其中30μg滴鼻组显著高于30μg皮下组(P＜0.01)。小鼠脾淋巴细胞增殖实验结果显示，30μg滴鼻组和60μg皮下组rTgGAP45增殖指数显著高于对照组(P＜0.01和P＜0.05)。3个免疫组肠冲洗液、鼻咽冲洗液IgA水平与对照组差异有统计学意义，其中30μg滴鼻组肠冲洗液和鼻咽冲洗液IgA水平均显著高于30μg和60μg皮下组(P＜0.01和P＜0.01);30μg滴鼻组和60μg皮下组阴道冲洗液IgA水平显著高于对照组(P＜0.01和P＜0.01)。3个免疫组脾淋巴细胞上清IL-2、IFN-γ水平高于对照组，且差异有统计学意义，30μg滴鼻组和60μg皮下组脾淋巴细胞上清IL-5、IL-4水平高于对照组(P＜0.01和P＜0.05; P＜0.01和P＜0.01)。30μg滴鼻组和60μg皮下组空肠、回肠、十二指肠黏膜细胞上清中IL-2、IFN-γ水平与对照组比较差异有统计学意义，其中30μg皮下组回肠黏膜细胞上清中IL-2水平与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05和P＜0.05)。 30μg滴鼻组和30μg、60μg皮下组（慢性感染）肝和脑虫荷均显著低于对照组（均为P＜0.01），减虫率分别为（49.55％和61.38％;33.78％和41.94％;43.82％和51.30％），其中30μg滴鼻组肝虫荷显著低于30μg皮下组(P＜0.05);30μg滴鼻组和60μg皮下组脑虫荷均显著低于30μg皮下组(P＜0.01;P＜0.01)。致死性感染实验中，PBS组、30μg皮下组小鼠分别在攻击后第10d、30d内全部死亡，30μg滴鼻组和60μg皮下组30 d生存率分别为50％和37.5％。 结论：生物信息学分析结果显示刚地弓形虫GAP45基因编码的蛋白存在4个潜在的抗原表位，可能具有抗原性。我们成功构建重组质粒pET30a-TgGAP45，而且证实滑行相关蛋白45在E.coli中高效表达，经Western blot实验证明重组rTgGAP45具备抗原特性。rTgGAP45免疫能诱导黏膜和系统免疫反应，并可部分抵抗弓形虫慢性和致死性感染，可望用于弓形虫疫苗候选抗原。

目录

声明

缩略词

摘要

第一章 文献综述 刚地弓形虫滑行相关蛋白(GAP)的研究进展

1 现阶段发现的滑行相关蛋白

2 GAP45、GAP50参与肌动球蛋白系统

3 GAP参与调控肌动球蛋白的动力学机制

4 GAP作为弓形虫候选抗原的展望

参考文献

第二章 刚地弓形虫滑行相关蛋白45(GAP45)的生物信息学分析

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三章 刚地弓形虫滑行相关蛋白45基因的克隆、表达及免疫鉴定

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第四章 重组滑行相关蛋白45(rTgGAP45)鼻内与皮下免疫小鼠诱导的免疫应答

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第五章 重组滑行相关蛋白45(rTgGAP45)免疫小鼠抗弓形虫慢性和致死性感染

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附录

附录Ⅰ 主要试剂的配制

附录 Ⅱ ELISA主要试剂溶液配制方法

致谢

个人简历