P2Y受体激动剂ADPβS的葡萄糖依赖性促胰岛素分泌机制的研究

摘要

目的:阐明P2Y嘌呤(P2Y)受体激动剂ADPβS的葡萄糖依赖性促胰岛素分泌的关键机制，获得P2Y受体介导胰岛β细胞Kv通道的可靠证据，为以P2Y受体为靶点的新型抗糖尿病药物的研究和开发提供理论依据。 方法: (1)处死大鼠后，无菌状态下打开腹腔，将配置好的胶原酶P从胆总管打入胰腺后剪下胰腺，38℃水浴震荡消化11 min，采用梯度离心法分出大鼠胰岛。用DispaseⅡ消化可得到大鼠胰岛β细胞，分得的胰岛和细胞最多使用7天。 (2)AO/PI染液孵育胰岛10 min，在荧光显微镜下用490 nm激发光，510nm发射光观察胰岛染色状态。 (3)将分得的胰岛培养过夜后，用放射性免疫分析法检测P2Y受体激动剂ADPβS在其它药物干预下对大鼠胰岛素分泌及环磷酸腺苷(cAMP)含量的影响。 (4)采用膜片钳技术检测ADPβS对胰岛β细胞电压依赖性钾通道(Kv)、动作电位(AP)及电压依赖性钙通道的影响。 (5)采用激光共聚焦技术检测ADPβS对胰岛β细胞内钙离子浓度的影响。 结果: (1)用胶原酶P分得的胰岛，DispaseⅡ分得的β细胞都状态良好。 (2)分离得到的胰岛经AO/PI染色后95％以上的胰岛发绿色荧光，表明胰岛活性良好。 (3)在胰岛素分泌实验中，0.5μM ADPβS有明显的葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌作用;P2Y受体抑制剂Suramin(50μM)和腺苷酸环化酶(AC)抑制剂SQ22536(10μM)都能消除ADPβS的促胰岛素分泌作用;与AC激动剂Forskolin(10μM)一样，0.5μM ADPβS明显增加细胞内的cAMP含量，且Suramin和SQ22536能够消除ADPβS的这种作用。蛋白激酶A(PKA)阻断剂PKI(10 nM)没有消除ADPβS的促胰岛素分泌作用，而Epac阻断剂ESI-09(10μM)消除ADPβS的促胰岛素分泌作用;Kv抑制剂TEA(20mM)增加胰岛素分泌，在TEA存在的基础上ADPβS未能进一步的促进胰岛素分泌。 (4)膜片钳实验表明，0.5μM ADPβS明显地抑制Kv通道电流，在80mV时，(ADPβS，113.46±10.81 pA/pF, n=6;对照组，142.29±8.64 pA/pF, n=6，p＜0.05);50μM Suramin和10μMSQ22536本身对Kv没有影响，但Suramin和SQ22536消除ADPβS对Kv的抑制作用;10 nM PKI没有改变ADPβS对Kv的抑制作用，而10μM ESI-09消除ADPβS对Kv的抑制作用;Kv通道阻断剂TEA(20 mM)存在时，ADPβS对Kv没有进一步发挥抑制作用。在检测动作电位时程(APD)的实验中，0.5μM ADPβS显著性的延长β细胞APD（ADPβS72.9±6.1 ms，n=8;对照组49.9±2.0 ms，n=8;p＜0.01）。0.5μM ADPβS对细胞上的电压依赖性钙通道没有影响，在0 mV时(ADPβS，-5.94±0.20 pA/pF,n=7;对照组，-5.78±0.19 pA/pF, n=7，p＞0.05)。 (5)激光共聚焦实验显示，在8.3mM的基础上，0.5μM ADPβS明显的增加β细胞内的钙离子浓度;50μM Suramin和10μM SQ22536都能够消除ADPβS升高β细胞内钙离子浓度的作用;20mMTEA明显的增加细胞内的钙离子浓度，0.5μM ADPβS未能进一步增加细胞内的钙浓度。 结论: (1)用胶原酶P分得的胰岛，DispaseⅡ消化得到的胰岛细胞外表圆润，状态良好。 (2)实验中分得的胰岛活性良好(AO/PI染色)。 (3) ADPβS具有葡萄糖依赖性的促进胰岛素分泌作用，且ADPβS的这种促胰岛素分泌作用被P2Y受体抑制剂Suramin、AC抑制剂SQ22536、Epac抑制剂ESI-09所消除，而PKA抑制剂PKI对ADPβS没有影响;ADPβS能明显升高细胞内的cAMP含量，且Suramin和SQ22536能够消除ADPβS升高cAMP的作用。 (4) ADPβS明显抑制Kv通道，而这种作用被Suramin、SQ22536、ESI-09所消除。 (5) ADPβS明显延长APD，对电压依赖性钙通道没有影响。 (6) ADPβS明显增加了胰岛细胞内的钙离子浓度，Suramin和SQ22536能够消除ADPβS升高钙离子浓度的作用。综上所述，ADPβS的葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌作用,主要是通过激动P2Y受体后激活AC，增加细胞内的cAMP含量，激活cAMP下游的Epac这个通路从而抑制Kv通道的开放，延长APD，增加钙离子进入细胞的时间，增加细胞内的钙离子浓度而促进胰岛素分泌。

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综述 P2Y受体研究进展及其在胰岛素分泌中的作用

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