使用腺病毒过表达TXNIP对INS--1胰岛细胞损伤和凋亡的影响

摘要

目的:使用腺病毒转染技术，通过在培养的胰岛细胞株过表达TXNIP蛋白及C247S点突变的TXNIP，观察TXNIP过表达是否可以引起正常培养条件下的胰岛细胞发生损伤和凋亡，并通过与C247S位点突变导致丧失与Trx结合能力的突变TXNIP过表达组的比较，分析TXNIP引起细胞损伤和凋亡的下游途径，以进一步明确TXNIP在糖尿病时引起各器官细胞损伤的机制。 方法: 1.使用腺病毒转染技术使胰岛细胞过表达TXNIP和247位点突变的TXNIP使用正在对数生长期的INS-1细胞，细胞分为4组，即:正常培养组、正常+不含目的基因的腺病毒对照组、正常+Ad-TXNIP过表达组、正常+Ad-TXNIPC247s点突变过表达组;在转染前一天分别换液处理，第二天进行转染，病毒滴度按每个细胞100个病毒颗粒计算。4h后补加10％胎牛浓度的1640培养基继续培养，24h后换液处理，继续培养至72h，中间持续时观察病毒转染效率。 2.确定转染效率利用荧光倒置显微镜拍摄同一个视野下的转染细胞，计算同一个视野下带绿色荧光蛋白细胞占整个视野下所有细胞的百分比计算转染效率。同时Real-timePCR方法测定转染INS-1胰岛素细胞TXNIP的mRNA表达水平。 3.分析比较两种TXNIP过表达组引起胰岛细胞损伤和凋亡的程度，并分析损伤的途径通过前两部分实验，确定转染率相对最高的时间点，收集各培养组的细胞和培养基测定乳酸脱氢酶(LDH)、p38激酶活性、caspase-3及Trx活性，并用western blot方法测TXNIP和Trx蛋白的表达量，同时使用免疫共沉淀方法确定Trx与TXNIP的结合情况。 结果： 1.荧光显微镜观察转染效率镜下观察转染成功，24h，48h，72h转染效率分别为:9.97±2.15％、67.45±3.37％、89.96±4.32％，其中转染72h的转染效率显著高于转染24h(P＜0.01)和转染48h(P＜0.01)，因此该部分实验我们选择转染72h的细胞做后续实验分析（图1）。 2.Real-time PCR方法测定转染INS-1胰岛细胞TXNIP的mRNA表达与正常培养组相比，Ad-eGFP组细胞TXNIP的mRNA水平无显著变化（mRNA1.11±0.17 vs.1.07±0.22; P＞0.05），TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad-eGFP组相比:TXNIP的mRNA表达显著升高（mRNA1.89±0.26 vs.1.07±0.22;P＜0.05），C247S点突变TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad-eGFP组相比:TXNIP的mRNA表达显著升高（mRNA1.89±0.32 vs.1.07±0.22;P＜0.05），说明构建载体、病毒包装、细胞转染、过表达目的基因成功（图2）。两个过表达组TXNIP的mRNA水平无明显差别。 3.Western Blot方法测定转染成功后TXNIP表达增高、Trx蛋白表达未见明显改变如图3所示，与正常对照组相比较，Ad-eGFP组的TXNIP蛋白表达无显著变化（1.04±0.05 vs.0.98±0.04;P＞0.05），而与Ad-eGFP组相比，Ad-TXNIP-eGFP组和Ad-TXNIPc247s-eGFP组的TXNIP蛋白水平均显著升高（1.92±0.07 vs.1.04±0.05;P＜0.01）(1.69±0.17vs.1.04±0.05;P＜0.01)，进一步说明病毒转染及蛋白过表达成功。与Ad-eGFP组相比较， Ad-TXNIP-eGFP组和Ad-TXNIPc247s-eGFP组，Trx蛋白表达均没有明显的变化（1.07±0.08 vs.1.03±0.05;P＞0.05）(1.09±0.07 vs.1.03±0.05;P＞0.05)，说明TXNIP表达增高并未抑制Trx的蛋白表达（见图4）。 4.免疫共沉淀方法检测我们使用免疫共沉淀方法反映TXNIP与Trx的结合程度。与正常培养组相比，Ad-eGFP组Trx与TXNIP的结合量无明显变化（0.96±0.04 vs.1.06±0.05;P＞0.05），与不含TXNIP的Ad-eGFP组，TXNIP过表达组相比，Trx与TXNIP的结合量显著升高（1.67±0.08 vs.1.06±0.05; P＜0.05），而C247S点突变的TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad-eGFP组相比无明显变化（0.87±0.04 vs.1.06±0.05;P＞0.05），提示C247S位点突变过表达的TXNIP不能与Trx相结合。（见图5） 5.Trx活性测定如图6所示:与正常培养组相比，Ad-eGFP组细胞Trx活性无明显变化（1.13±0.14 vs.1.00±0.12;P＞0.05），与不含TXNIP的Ad-eGFP组相比，TXNIP过表达组Trx活性显著降低（0.42±0.11vs.1.00±0.12;P＜0.01），提示TXNIP的过表达虽不会引起Trx的蛋白表达量的改变，但是会明显的抑制Trx的活性。C247S点突变的TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad-eGFP组细胞相比，Trx活性无明显变化(0.84±0.09 vs.1.00±0.12;P＞0.05)，而与野生型的TXNIP过表达组相比，C247S点突变的TXNIP过表达组细胞Trx活性明显升高（0.84±0.09 vs.0.42±0.11;P＜0.01），提示TXNIP主要通过其247位的半胱氨酸与还原型的Trx结合抑制其活性。 6.乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化乳酸脱氢酶(LDH)活性被用来反应细胞损伤的程度。如图7所示:与正常培养组相比，Ad-eGFP组LDH活性没有显著性的差异（295.6±37.22U/L vs.266.2±36.49U/L;P＞0.05），TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad-eGFP组相比显著升高(498.8±55.62U/L vs.266.2±36.49U/L;P＜0.01)，提示TXNIP表达增高可引起胰岛细胞损伤。C247S点突变的TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad-eGFP组相比，LDH活性也明显升高(421.6±41.31U/L vs.266.2±36.49U/L;P＜0.05)，但与野生型的TXNIP过表达组相比，LDH活性较低(421.6±41.31U/L vs.498.8±55.62U/L， P＜0.05)，提示TXNIP可以通过Trx依赖和非Trx依赖两条途径引起胰岛细胞损伤。 7.caspase-3活性测定caspase-3的激活是细胞凋亡发生的主要途径，如图8所示，与正常培养组相比，Ad-eGFP组caspase-3活性无显著差异（0.873±0.11 nmol/h/mg pro vs.0.979±0.10nmol/h/mg pro; P＞0.05），而TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad-eGFP组相比，caspase-3活性明显增高(3.799±0.33nmol/h/mg pro vs.0.979±0.10nmol/h/mg pro; P＜0.01)，提示TXNIP过表达引起胰岛细胞显著的凋亡。C247S点突变的TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad-eGFP组相比，caspase-3活性明显升高(3.377±0.29U/L vs.0.979±0.10nmol/h/mg pro,P＜0.01)，但与野生型的TXNIP过表达组相比，caspase-3活性较低(3.377±0.29U/L vs.3.799±0.33nmol/h/mg pro;P＜0.05)，提示TXNIP可以通过Trx依赖和非Trx依赖两条途径引起胰岛细胞损伤。 8.p38激酶活性p38激酶是激活caspase系统依赖的凋亡，介导氧应激损伤的重要途径。如图9所示，与正常培养组相比，Ad-eGFP组p38激酶活性无明显改变(1.10±0.15vs.1.04±0.08; P＞0.05)，而TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad-eGFP组相比p38激酶活性显著升高(2.45±0.22 vs.1.04±0.08; P＜0.01)。C247S点突变的TXNIP过表达组与不含TXNIP的Ad-eGFP组相比，p38激酶活性无明显改变（0.80±0.07vs.1.04±0.08; P＞0.05），且明显低于野生型的TXNIP过表达组，（0.80±0.07 vs.2.45±0.22; P＜0.01），提示TXNIP过表达引起的p38激酶活化主要是通过结合和抑制Trx活性，增加自由基的生成和堆积所介导的。 结论：在正常培养的胰岛细胞，单纯过表达TXNIP即可引起细胞损伤和凋亡的发生，通过与丧失结合抑制Trx能力的突变TXNIP的对比，可以证明TXNIP介导的损伤，既有通过结合抑制Trx，削弱其抗自由基功能，激活p38激酶的Trx依赖途径，也有不依赖于Trx和p38激酶的非Trx依赖途径参与。

目录

声明

摘要

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要试剂与仪器

2．2 实验分组

2．3 实验方法

2．4 统计分析

3 结果

3．1 荧光显微镜观察转染效率

3．2 Real-time PCR方法测定转染INS-1胰岛细胞TXNIP的mRNA表达

3．3 Western Blot方法测定转染成功后TXNIP表达增高、Trx蛋白表达未见明显改变

3．4 免疫共沉淀方法检测

3．5 Trx活性测定

3．6 乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化

3．7 caspase-3活性测定

3．8 p38激酶活性

4 讨论

参考文献

附图

综述 Trx、TXNIP通过氧化应激对糖尿病胰岛功能损伤影响的研究进展

个人简介

致谢