尼古丁对NCI-H1975和NCI-H460细胞促进增殖作用及对PI3K/Akt通路的影响研究

摘要

背景：
　　肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，病死率高、五年生存率低。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将肺癌按病理类型分为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer，SCLC）。肺癌的形成原因十分复杂，其中吸烟与肺癌尤其是NSCLC有直接关系。尼古丁为香烟中最主要生物碱，虽然目前研究表明尼古丁没有直接致癌作用，但却具有促进肿瘤细胞增殖加快肿瘤生长的作用。
　　3-磷酸肌醇激酶（Phosphoinositide3-kinase，PI3K）家族成员是肌醇与磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）的重要激酶。活化的PI3K引起Akt构象的改变，并且磷酸化Akt蛋白，致其活化。Akt磷酸化后能够通过激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-kappaB、Forkhead、mTOR等，经多条途径促进细胞存活。PI3K/Akt信号通路在对多种细胞的增殖和存活起着重要作用，已有研究显示许多肿瘤中都存在PI3K/Akt信号通路的过度活化。本研究的基本思路是观察尼古丁对不同病理来源NSCLCs作用差异，检测 PI3K/Akt通路基因表达变化，探求尼古丁对不同病理来源NSCLCs作用产生差异的可能机制，为建立针对不同病理类型NSCLCs治疗方法提供理论基础。
　　目的：
　　探讨尼古丁对不同病理来源NSCLCs作用差异和可能机制，为建立寻找针对不同病理类型NSCLCs治疗提供理论依据。
　　方法：
　　分别利用 CCK-8细胞毒性试剂盒及流式细胞术检测尼古丁对人肺腺癌细胞NCI-H1975和人大细胞肺癌细胞NCI-H460的促进增殖和抑制凋亡作用。利用Western blot和RT-PCR技术检测尼古丁作用后NCI-H1975和NCI-H460细胞PI3K/Akt通路关键基因mRNA及蛋白表达的改变，建立尼古丁对不同病理类型NSCLCs细胞作用产生差异的分子机制。
　　结果：
　　1、CCK-8检测结果显示尼古丁对 NCI-H1975、NCI-H460细胞均有促进增殖的作用，与对照组具有统计学意义（ P<0.05），具有时间依赖性（ NCI-H1975，y=102.5e0.056x， R2=0.982；NCI-H460，y=102.5e0.056x， R2=0.976）及剂量依赖性（ NCI-H1975，y=11.72ln(X)+100.4， R2=0.994；NCI-H460，y=10.90ln(x)+99.68， R2=0.996），但NCI-H1975对尼古丁反应更迅速，更敏感，变化更大。
　　2、流式细胞术检测结果显示尼古丁能显著降低顺铂导致的 NCI-H1975、NCI-H460细胞凋亡（P<0.05），具有时间依赖性（NCI-H1975，y=66.48x0.84，R2=0.979；NCI-H460，y=63.98x0.84，R2=0.985），但NCI-H1975对尼古丁反应更迅速，更敏感，变化更大。
　　3、Western blot及 RT-PCR检测结果显示尼古丁干预后随尼古丁浓度增大NCI-H1975细胞PI3K mRNA表达增加、Bad/Caspase9/FoxO3a/mTOR mRNA表达下降，随尼古丁浓度增大 NCI-H1975细胞 PI3K/p-Akt/p-Bad/p-Caspase9/p-FoxO3a/p-mTOR蛋白表达增加、Bad/FoxO3a/mTOR表达下降；随尼古丁作用时间增加NCI-H1975细胞PI3K mRNA表达增加、Bad/FoxO3a/mTOR mRNA表达下降，随尼古丁作用时间增加 NCI-H1975细胞 PI3K蛋白表达增加、Bad/Caspase9/FoxO3a/mTOR表达下降。尼古丁干预后随尼古丁浓度增大 NCI-H460细胞 PI3K mRNA表达增加、Bad/FoxO3a/mTOR mRNA表达下降，随尼古丁浓度增大NCI-H460细胞 PI3K/p-Akt/p-Bad/p-mTOR蛋白表达增加、Bad/FoxO3a/mTOR表达下降；随尼古丁作用时间增加NCI-H460细胞PI3K mRNA表达增加、Bad/FoxO3a/mTOR mRNA表达下降，随尼古丁作用时间增加 NCI-H460细胞 PI3K蛋白表达增加、Bad/FoxO3a/mTOR表达下降。
　　4、尼古丁对NCI-H1975、NCI-H460细胞Caspase9和FoxO3a两蛋白作用出现差异。
　　结论：
　　1、尼古丁对NCI-H1975、NCI-H460细胞有促进增殖和抑制凋亡作用，且作用具有剂量依赖性和时间依赖性。
　　2、NCI-H1975和NCI-H460细胞对尼古丁反应不同。
　　3、尼古丁可能通过调节PI3K/Akt通路下游Bad、Caspase9、FoxO3a、mTOR基因表达水平及磷酸化水平来调节NCI-H1975和NCI-H460细胞增殖与凋亡。。
　　4、NCI-H1975和NCI-H460细胞对尼古丁的反应不同，具体表现在Caspase9和FoxO3a的表达水平变化不同，这可能由于两细胞对尼古丁反应后激活信号通路不同所致。

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前言

第一部分 尼古丁对NCI-H1975和NCI-H460增殖和凋亡的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 尼古丁对NCI-H1975 PI3K/Akt通路的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三部分 尼古丁对NCI-H460细胞PI3K/Akt通路的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

综述:尼古丁及其对肺癌的作用

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