糖尿病诱发大鼠感觉神经病变及其对心肌缺血再灌注神经反应的生物化学特征

摘要

目的：
　　探讨糖尿病大鼠热痛阈值改变以及支配心脏感觉神经细胞生物学和 P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)表达的改变及其在心肌缺血/再灌注病理性刺激作用下变化特征。
　　方法：
　　(1) II型糖尿病大鼠模型的建立。180-200g雄性SD大鼠16只采用高糖高脂饲料喂养附加小剂量链脲佐菌素(STZ,30mg/kg)腹腔注射制作2型糖尿病大鼠(DM组)模型。另外取16只同质动物采用普通饲料喂养作为正常对照组(C组)。每周测量一次大鼠的体重和空腹血糖。应用酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法分别测量饲养四周和终末的血清胰岛素含量和血清甘油三酯含量。
　　(2) II型糖尿病诱发大鼠感觉神经退化及支配心脏感觉神经细胞对心肌缺血/再灌注神经反应性的病理改变。实验中每周测量一次大鼠的甩尾潜伏期。在动物注射STZ10周后将DM组和 C组又分别随机分为缺血再灌注组(I/R组)和假手术组(Sham组)两个亚组，通过结扎左冠状动脉前降支的方法缺血30分钟再灌注120分钟制造缺血/再灌注模型，取DM组及C组动物上胸段(T1-T5)背根神经节，采用免疫荧光技术和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别对神经节细胞数量、分类及 SP和 CGRP的表达进行分析。
　　(3)Ⅱ型糖尿病感觉神经病变大鼠心肌缺血/再灌注对心肌组织内感觉神经肽 SP、CGRP表达的影响。在动物注射STZ10周后将DM组和C组又分别随机分为缺血再灌注组(I/R组)和假手术组(Sham组)两个亚组,采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备心脏缺血再灌注模型。采用免疫荧光双标技术和酶联免疫吸附试验(ELISA)对左室缺血心肌组织内的SP和CGRP的表达进行定位和定量研究，对血清内的SP和CGRP的表达进行定量研究。
　　(4)II型糖尿病感觉神经病变大鼠心肌缺血/再灌注后去甲肾上腺素及β1-肾上腺素能受体在心肌表达的改变。实验分组同（2）和（3），应用酶联免疫吸附实验（ELISA）的方法分别对血清和左室缺血心肌组织内的去甲肾上腺素（NE）进行定量分析，应用Western Blot的方法测量β1受体的表达水平，观察糖尿病对大鼠心肌组织内交感神经反应活性的影响。
　　结果：
　　(1)糖尿病组经过四周高糖高脂饲料喂养体重比正常对照组有增加的趋势，并且出现胰岛素含量增高（P<0.05）和胰岛素敏感性降低(P<0.05)。注射 STZ后10周内糖尿病动物体重较对照组显著减轻（P<0.05）。糖尿病组空腹血糖较对照组显著升高(P<0.01)。DM组的血清胰岛素含量较对照组降低(P<0.05)。DM组的血清甘油三酯含量较对照组虽然有增高的趋势，但差别没有统计学意义。
　　(2)糖尿病组甩尾时间较对照组显著延长(P<0.01)。DRG内SP和CGRP阳性神经元丰富，糖尿病大鼠的 SP和 CGRP阳性表达明显减弱（P<0.05），糖尿病大鼠的CGRP表达阳性神经细胞减少46％,小细胞减少70%，SP表达阳性神经细胞减少62%，小细胞减少59%; SP和CGRP免疫反应阳性物质集中在脊髓背角浅层（Ⅰ、Ⅱ层）;正常缺血再灌注组(C-I/R)与正常假手术组(C-SHAM)比较:DRG内 CGRP含量明显上升(P=0.001)。糖尿病缺血再灌注组(D-I/R)与糖尿病假手术组(D-SHAM)比较:DRG内CGRP含量明显上升(P=0.001)。糖尿病假手术组(D-SHAM)与正常假手术组(C-SHAM)比较:DRG内 CGRP含量明显下调(P=0.001)。糖尿病缺血再灌注组(D-I/R)与正常缺血再灌注组(C-I/R)比较:DRG内CGRP和SP都明显下调(P<0.01)。
　　(3)心脏内 CGRP和 SP免疫反应阳性神经纤维多见于心外膜和心肌层,尤其是围绕血管周围及血管内皮有强阳性反应,糖尿病大鼠CGRP和SP免疫反应阳性神经纤维明显减少。正常缺血再灌注组(C-I/R)与正常假手术组(C-SHAM)比较:左室缺血心肌组织和血清内CGRP和SP均明显上调(P<0.05)。糖尿病缺血再灌注组(D-I/R)与糖尿病假手术组(D-SHAM)比较:左室缺血心肌组织和血清内CGRP明显上调(P<0.05)。糖尿病假手术组(D-SHAM)与正常假手术组(C-SHAM)比较:左室缺血心肌组织和血清内CGRP和SP均明显下调(P<0.05)。糖尿病缺血再灌注组(D-I/R)与正常缺血再灌注组(C-I/R)比较:左室缺血心肌组织和血清内CGRP和SP均明显下调(P<0.05)。
　　(4)左心室缺血心肌组织NE含量：无论是DM组内还是对照组内Sham组均较I/R组有增高趋势，但差别没有统计学意义，DM组和对照组的含量比较也没有差别。血清NE含量：DM组和对照组的比较有一定的降低趋势，但差异没有统计学意义，但各组内I/R组均较Sham组有显著增高（P<0.05）。Western Blot的方法测量β1受体的表达情况：C-SHAM比C-I/R的表达量增高（P<0.05）。D-SHAM比D-I/R也有增高趋势，但差别没有统计学意义。DM组和对照组比较，有降低趋势，但差别没有统计学意义。
　　结论：
　　(1)单纯应用高糖高脂饲料喂养，糖尿病组的大鼠体重显著的增加，并且出现了一定程度的胰岛素含量的增高和胰岛素敏感性的降低；在此基础上注射小剂量链脲佐菌素，诱发血糖显著增高。饲养过程中，糖尿病组的大鼠出现了类似人类2型糖尿病三多一少的典型表现，并且有毛发凌乱和精神萎靡的病态特征。注射 STZ10周后， DM组的胰岛素相对缺乏，甘油三酯有增高的趋势。
　　(2)糖尿病诱发显著感觉神经功能退化；糖尿病动物在心肌缺/血再灌注中支配心脏的感觉神经细胞内CGRP和SP显著低于非糖尿病组，提示神经细胞的反应性减退。
　　(3)糖尿病心脏内的感觉神经也出现退化，对缺血/再灌注状态下心肌组织内感觉神经肽CGRP和SP的表达水平显著低于非糖尿病动物，该差异提示CGRP、SP下调可能参与了糖尿病大鼠心脏缺血再灌注损伤的病理生理学过程。
　　(4)糖尿病对心脏β1肾上腺素能受体水平有所影响。其生物学意义有待进一步研究。

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前言

第一部分:Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第二部分:Ⅱ型糖尿病诱发大鼠感觉神经退化及支配心脏感觉神经细胞对心肌缺血/再灌注神经反应性的病理改变

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第三部分:Ⅱ型糖尿病感觉神经病变大鼠心肌缺血/再灌注对心肌组织内感觉神经肽SP、CGRP表达的影响

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第四部分: Ⅱ型糖尿病感觉神经病变大鼠心肌缺血/再灌注后去甲肾上腺素及β1-肾上腺素能受体在心肌表达的改变

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述: 糖尿病神经病变与心血管疾病关系的研究进展

致谢

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