不同剂量黄芩苷对子痫前期模型大鼠肾小管上皮细胞AT-1、Caspase-9、Bcl-2的表达及肾细胞凋亡率的影响

摘要

子痫前期（Preeclampsia，PE）是最常见的妊娠期特发性疾病之一，以高血压、蛋白尿及水肿为主要表现，是孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一。肾脏是子痫前期最易受损的器官，蛋白尿的出现与肾脏损伤有关，临床上常以蛋白尿量的多少作为评估子痫前期病情轻重的指标之一。目前发现细胞凋亡与子痫前期的发生有关联。AT-1是RAS系统血管紧张素II的受体，可通过与Ang II结合诱导细胞凋亡；Caspase-9位于细胞凋亡通路上游，属于凋亡启动因子的一种，前期研究发现子痫前期患者胎盘滋养细胞的凋亡增加，Caspase-9表达水平升高。Bcl-2是凋亡抑制蛋白， Bcl-2表达升高，可抑制细胞凋亡。黄芩苷可抑制细胞凋亡，中国传统医学中有大量的含有黄芩苷的处方治疗孕期并发症的经验，关于其具体机制尚未阐明。
　　目的：
　　通过建立子痫前期大鼠模型，检测不同剂量黄芩苷对肾小管上皮细胞AT-1、Caspase-9及Bcl-2的表达的影响及肾脏组织细胞凋亡率的影响，揭示黄芩苷的治疗机制。
　　方法：
　　75只雌性Wistar大鼠随机分为2组，A组为对照组，于妊娠第13天起给予皮下注射生理盐水，B组为子痫前期组，于妊娠第13天起皮下注射亚硝基左旋精氨酸甲酯（一氧化氮合酶抑制剂）[125mg/（kg·d）]，于妊娠第16天将2组再次随机分为四组，分别是空白对照亚组及低、中、高剂量黄芩苷干预亚组，黄芩苷干预亚组分别给与予腹腔注射不同剂量黄芩苷50mg/（kg·d）、100mg/（kg·d）、150mg/（kg·d），空白对照亚组给予腹腔注射生理盐水0.5ml。所有妊娠大鼠均于妊娠第10、16、19天测量大鼠尾动脉压及孕鼠24h尿蛋白。妊娠第21天处死大鼠，无菌操作下留取完整肾脏组织，利用免疫组织化学方法检测肾小管上皮细胞中Caspase-9、Bcl-2及AT-1受体的表达位置，检测灰度值测其表达水平；用TUNEL法测定肾脏组织中凋亡细胞率。所有数据均用SPSS17.0软件进行统计学分析，两独立正态分布样本间比较用t检验；不同时间点均数比较采用重复测量方差分析；多组间相同指标均数比较采用F检验、LSD-t检验进行评价，以α=0.05为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.妊娠第10天，子痫前期组与对照组相比，尾动脉收缩压[(107.80±5.93)VS(109.20±4.51)]mmHg,t=1.01,P=0.32;舒张压[(78.75±6.80) VS(77.47±9.93)]mmHg,t=0.59,P=0.56;24小时尿蛋白[(6.11±0.54)VS(6.24±0.27)]mg/24h,t=0.85,P=0.40，差异无统计学意义；
　　2.妊娠第16天，给予L-NAME后的大鼠尾动脉血压、24小时尿蛋白较对照组明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，提示子痫前期模型复制成功；
　　3.妊娠第19天，即黄芩苷干预后4天比较各组：
　　（1）空白对照亚组与对照组孕鼠相比，收缩压[(144.60±5.32) VS(118.67±4.95)]mmHg，t=7.79,P＜0.001;舒张压[(90.80±6.42) VS(81.60±6.67)]mmHg，t=3.22,P=0.002;24小时尿蛋白[(11.14±0.62)VS(6.24±0.26)]mg/24h，t=20.53,P＜0.001，差异具有统计学意义；
　　（2）高、中、低剂量干预亚组与空白对照亚组相比，收缩压[(130.13±5.71) VS(122.60±3.91) VS(108.87±17.72) VS(144.60±5.32)]mmHg，t值分别为10.74、6.62、4.35；P值均小于0.001；舒张压[(82.40±7.60) VS(81.33±5.50) VS(75.73±11.54) VS(90.80±6.42)]mmHg、t值分别为5.27、3.31、2.94；P值分别为0.001、0.001、0.004；24小时尿蛋白[(6.91±0.34) VS(7.07±0.28) VS(7.31±1.22) VS(11.14±0.62)]mg/24h，t值分别为16.04、17.05、17.69；P值均小于0.001，差异均具有统计学意义；
　　（3）高、中、低剂量干预亚组与对照组相比，收缩压[(130.13±5.71) VS(122.60±3.91) VS(118.87±17.72) VS(108.67±4.95)]mmHg，t值分别为2.95、1.18、3.45P值分别为0.004、0.241、0.001，舒张压[(82.40±7.60) VS(81.33±5.50) VS(75.73±11.54) VS(81.60±6.67)]mmHg，t值分别为2.05、0.09、0.28；P值分别为0.044、0.926、0.781；24小时尿蛋白[(6.91±0.34) VS(7.07±0.28) VS(7.31±1.22) VS(6.24±0.26)]mg/24h，t值分别为4.49、3.49、2.84；P值分别为0.001、0.001、0.006；差异均具有统计学意义；
　　（4）低剂量干预亚组与中剂量干预亚组相比，收缩压[(130.13±5.71) VS(122.60±3.91)]mmHg，t=2.27,P=0.027，差异具有统计学意义；舒张压[(82.40±7.60)VS(81.33±5.50)]mmHg,t=0.37,P=0.71;24小时尿蛋白[(6.91±0.34)VS(7.07±0.28)]mg/24h,t=0.64,P=0.52,差异无统计学意义。
　　（5）低剂量干预亚组与高剂量干预亚组相比，收缩压[(130.13±5.71) VS(108.87±17.72)]mmHg,t=6.39,P=0.001;舒张压[(82.40±7.60)VS(75.73±11.54)]mmHg,t=2.33,P=0.023，差异具有统计学意义;24小时尿蛋白[(6.91±0.34)VS(7.31±1.22)]mg/24h,t=-1.65,P=0.104,差异无统计学意义。
　　（6）中剂量干预亚组与高剂量干预亚组相比，收缩压[(122.60±3.91) VS(108.87±17.72)]mmHg,t=4.13,P=0.001,差异具有统计学意义（P＜0.05)；舒张压[(81.33±5.50)VS(75.73±11.54)]mmHg,t=1.96,P=0.054,24小时尿蛋白[(7.07±0.28)VS(7.31±1.22)]mg/24h,t=-1.0048,P=0.32,差异无统计学意义。
　　4.免疫组化检测各组AT-1表达比较：
　　（1）空白对照亚组与对照组相比,灰度值[(130.63±3.15)VS(165.94±2.32),t=48.35,P＜0.001],差异具有统计学意义；
　　（2）低、中、高剂量黄芩苷干预亚组与空白对照亚组相比，灰度值[(138.95±0.86) VS(147.72±0.84) VS(156.42±1.78) VS(130.63±3.15)]，t值分别为13.03、24.93、36.95，P值均小于0.001，差异具有统计学意义；
　　（3）低剂量干预亚组与中剂量干预亚组相比，灰度值[(138.95±0.86)VS(147.72±0.84)，t=11.91,P＜0.001],差异具有统计学意义；
　　（4）低剂量干预亚组与高剂量干预亚组相比，灰度值[(138.95±0.86)VS(156.42±1.78),t=23.92,P＜0.001],差异具有统计学意义；
　　（5）中剂量干预亚组与高剂量干预亚组相比，灰度值[(147.72±0.84)VS(156.42±1.78),t=12.01,P＜0.001],差异具有统计学意义。
　　5.免疫组化检测各组Caspase-9表达比较：
　　（1）空白对照亚组与对照组相比，灰度值[(92.09±2.86)VS(143.61±4.06),t=-48.94,P＜0.001],差异具有统计学意义；
　　（2）低、中、高剂量黄芩苷干预亚组与空白对照亚组相比，灰度值[(102.01±2.04) VS(118.41±2.63) VS(130.18±2.41) VS(92.09±2.86)]，t值分别为9.42、25.00、36.18，P值均小于0.001，差异具有统计学意义；
　　（3）低剂量干预亚组与中剂量干预亚组相比，灰度值[(102.01±2.04)VS(118.41±2.63)，t=-15.58,P＜0.001],差异具有统计学意义；
　　（4）低剂量干预亚组与高剂量干预亚组相比，灰度值[(102.01±2.04)VS(130.18±2.41),t=-26.76,P＜0.001],差异具有统计学意义；
　　（5）中剂量干预亚组与高剂量干预亚组相比，灰度值[(118.41±2.63)VS(130.18±2.41),t=-11.18,P＜0.001],差异具有统计学意义。
　　6.免疫组化检测各组Bcl-2表达比较：
　　（1）空白对照亚组与对照组相比，灰度值[(170.41±3.28)VS(124.75±1.60),t=66.90,P＜0.001],差异具有统计学意义；
　　（2）低、中、高剂量黄芩苷干预亚组与空白对照亚组相比，灰度值[(158.45±1.62) VS(145.03±0.74) VS(138.07±0.98) VS(170.41±3.28)]，t值分别为20.46，37.19，47.39，P值均小于0.001，差异具有统计学意义；
　　（3）低剂量干预亚组与中剂量干预亚组相比，灰度值[(158.45±1.62)VS(145.03±0.74)，t=13.73,P＜0.001],差异具有统计学意义；
　　（4）低剂量干预亚组与高剂量干预亚组相比，灰度值[(158.45±1.62)VS(138.07±0.98),t=26.93,P＜0.001],差异具有统计学意义；
　　（5）中剂量干预亚组与高剂量干预亚组相比，灰度值[(145.03±0.74)VS(138.07±0.98),t=10.20,P＜0.001],差异具有统计学意义。
　　7.TUNEL法测定凋亡细胞：
　　（1）空白对照亚组肾小管上皮细胞凋亡细胞明显增多，与对照组比较，[(19.80±3.05)VS(4.00±0.76)，t=18.85,P＜0.001]，差异具有统计学意义；
　　（2）低、中、高剂量黄芩苷干预亚组与空白对照亚组相比，凋亡细胞数分别为[(14.67±1.49)VS(11.53±1.41)VS(11.33±3.49)VS(19.80±3.05)],t值分别为6.12、9.86、10.10，P值均小于0.001，差异均具有统计学意义；
　　（3）低剂量干预亚组与中剂量干预亚组相比，凋亡细胞数[(14.67±1.49)VS(19.80±3.05)，t=3.74,P＜0.001]；与高剂量干预亚组相比：[(14.67±1.49)VS(11.33±3.49)，t=3.98,P＜0.001]，差异均具有统计学意义；
　　（4）中剂量黄芩苷干预亚组与高剂量干预亚组相比，凋亡细胞数[(19.80±3.05)VS(11.33±3.49)，t=0.24,P=0.812]，差异无统计学意义。
　　结论：
　　1.子痫前期组大鼠尾动脉压及24小时尿蛋白升高，结合光镜下肾脏组织HE染色病理表现，提示子痫前期模型复制成功。
　　2.黄芩苷使子痫前期大鼠肾小管上皮细胞中AT-1、Caspase-9表达减少，Bcl-2的表达增加，可减少肾小管上皮细胞凋亡率，提示黄芩苷可通过抑制子痫前期大鼠肾小管上皮细胞凋亡发挥作用。
　　3.黄芩苷可改善子痫前期大鼠肾脏功能，但其具有剂量依赖性，临床剂量有待进一步研究。