1,25(OH)2D3对类风湿关节炎破骨细胞形成影响可能机制的研究

摘要

背景：
　　骨破坏是类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA)的一大重要特点，且骨破坏程度与疾病严重程度及疾病导致的功能丧失密切相关。导致RA骨破坏的主要原因是滑膜炎，同时还有炎性因子和RANKL的分泌增加以及抗瓜氨酸组蛋白抗体的产生增加。既往研究发现，炎性细胞因子、自身抗体和RANKL均可刺激具有骨吸收功能的破骨细胞的分化，同时，体内有多条信号通路（如 JAK-2/STAT-3和p38 MAPK/NF-κB通路等）通过不同的作用机制影响破骨细胞的增殖分化。近年来多项研究表明，维生素D缺乏普遍存在于RA患者，且增加维生素D摄入，可以延缓和控制 RA的发生发展。而维生素 D的经典作用是维持体内钙、磷平衡的调节，近年来的研究发现其还在调节机体免疫功能中发挥重要作用，故把它划分为一种新型的免疫抑制剂。我们前期的研究发现，（1）IL-22在RA疾病过程中有促进炎症和促进破骨细胞形成的作用；（2）1,25(OH)2D3可降低RA患者血清中IL-22水平，且呈剂量依赖性抑制RANKL表达；（3）1,25(OH)2D3能够经过阻断 IL-22下游的 JAK-2/STAT-3和p38 MAPK/NF-κB通路来抑制RANKL的分泌。本研究将进一步通过比较各给药组破骨细胞分化的情况，来直观的观察1,25(OH)2D3能否通过阻断这一信号通路，来抑制破骨细胞的生成。
　　目的：
　　1.研究1,25(OH)2D3是否能够抑制破骨细胞的增殖分化；
　　2.研究1,25(OH)2D3是否能通过阻断 IL-22下游的 JAK-2/STAT-3和p38MAPK/NF-κB通路来抑制RA破骨细胞的生成。
　　方法：
　　1.从健康志愿者外周血中分离 PBMCs，用 RANKL（30ng/mL）、M-CSF（25ng/mL）诱导PBMC分化成破骨细胞，用1,25(OH)2D3（1nM）干预：分为以下3组：A组 PBMC+M-CSF；B组 PBMC+M-CSF+RANKL；C组PBMC+M-CSF+RANKL+1,25(OH)2D3。于培养的第14d终止培养，固定玻片上细胞并对细胞进行TRAP染色，镜下观察破骨细胞形成情况；用RT-PCR检测所加药物对破骨细胞表面的标志物TRAP、组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶（MMP）-9 mRNA的表达的影响。
　　2.从RA患者的滑膜组织中分离培养FLS至4~8代；从健康志愿者外周血分离出PBMCs,均加入M-CSF（25ng/mL）预处理；3d后，将两者共培养，同时按分组加入RANKL（30ng/mL）、M-CSF（25ng/mL）、IL-22（10ng/mL）、1,25(OH)2D3（1nM）、信号转导蛋白抑制剂等药物，分为以下五组：a组：PBMC+RA-FLS+M-CSF；b组：PBMC+RA-FLS+M-CSF+RANKL；c组：PBMC+RA-FLS+M-CSF+IL-22+1,25(OH)2D3；d组：PBMC+ RA-FLS+M-CSF+1,25(OH)2D3+IL-22+AG490（JAK-2抑制剂）；f组：PBMC+RA-FLS+M-CSF+1,25(OH)2D3+IL-22+SB203580（p38-MAPK抑制剂）。于共培养的第14d终止培养，固定玻片上细胞并行TRAP染色，观察破骨细胞生成的情况；用RT-PCR检测所加药物对破骨细胞表面的标志物TRAP、组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶（MMP）-9 mRNA的表达的影响。
　　3.数据分析采用SPSS17.0软件。
　　结果：
　　1.实验一中A、B、C三组破骨细胞（TRAP染色阳性的多核细胞）数量分别为7±0.816（个）、30±2.944（个）、5±2.16（个），B组较A组细胞数量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；C组较B组细胞数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　2.B组破骨细胞标志物TRAP、组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶（MMP）-9 mRNA的表达较A、C两组高，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　3.实验二中a组、b组、c组、d组、f组的破骨细胞数量依次是7.5±1.732（个）、38.5±3.416（个）、0.5±0.477（个）、21.75±3.775（个）、9±2.944（个）；b组较a组细胞数量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；c,d,f三个组细胞数量较b组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；d组和f组的细胞数量较c组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　4.a组、c组、d组及f组中TRAP、组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶（MMP）-9 mRNA表达量均较b组低，a组与c组间差异无统计学意义（P>0.05），d组与f组间差异亦无统计学意义（P>0.05）；其余组间差异均有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　1.1,25(OH)2D3能够抑制外周血破骨细胞的分化增殖；
　　2.1,25(OH)2D3能够通过阻断 IL-22下游的 JAK-2/STAT-3和p38-MAPK NF-κB通路，抑制RA患者破骨细胞的生成。

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中英文缩略词表

前言

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.2 主要试剂和材料

1.3 实验方法与分组

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 实验一结果

2.2 实验二结果

3 讨论

4 结论

参考文献

综述:维生素D对自身免疫病骨代谢的影响

附录

在学期间承担/参与的科研课题与研究成果

个人简历

致谢