增龄对小鼠肺纤维化模型上皮间质转化及Snail影响的研究

摘要

目的：
　　研究不同年龄段（青年、老年）小鼠实验性肺纤维化中上皮细胞-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关指标：上皮细胞标志物E-钙粘蛋白(E-Cadherin, E-Cad)，间质细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle Actin，α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)及转录因子Snail随病程进展的表达变化，初步探讨增龄对小鼠肺纤维化病变程度及EMT的影响，为进一步探索增龄促进肺纤维化进展的可能机制提供依据。
　　方法：
　　20周龄雄性C57/BL6小鼠60只，随机分为两组：青年组（20周龄）、老年组（饲养至26周龄）。上述两组每组再随机分为5组，其中1组作为生理盐水对照组(NS)，给予气管内注入0.9％氯化钠注射液，于第28d处死；其余4组为肺纤维化模型组，按5mg/kg剂量，予气管内注入博来霉素(bleomycin,BLM)，分别于造模后第7d、14d、21d及28d处死，取左肺制备石蜡切片，右肺液氮冻存后行相关蛋白RT-PCR检测。石蜡切片行HE染色及Masson染色，通过肺组织形态改变从而判断肺纤维化病变进展程度；免疫组织化学染色检测EMT相关指标 E-Cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白的表达水平，平均光灰度值使用美国Universal Imaging Porporation图像分析系统测量，反映病程中EMT的动态变化；RT-PCR法检测液氮冻存肺组织转录因子Snail1、Snail2及其调控蛋白E-cad的mRNA的表达水平。使用SPSS19.0对上述数据进行统计分析，所有数据均采取“均数标准差”表示，P<0.05，差异有统计学意义。
　　结果：
　　HE染色及Masson染色结果示BLM诱导的小鼠肺纤维化模型组，随病程进展，肺实质破坏、胶原生成量较对照组增加明显，表明造模成功。将老年与青年小鼠同时间点的纤维化病变程度进行对比，前者更严重。免疫组化法结果显示，E-Cadherin主要表达于肺泡上皮细胞、支气管黏膜上皮细胞。青年、老年两组小鼠对照组表达较多，各时间点模型组的表达较对照组减少，且随病程进展，减少更为明显，差异有统计学意义（P<0.05）；进一步将两组模型小鼠的各个对应时间点表达量进行比较，老年较青年组表达较少（P<0.05），而两组对照组无明显差异。Vimentin主要表达于支气管黏膜上皮及肺间质细胞，α-SMA在对照组只表达于支气管及血管平滑肌细胞，而在模型组肺间质肌成纤维细胞中还可观测到其表达。上述两个指标在各时间点模型组表达较对照组增加，随病程进展，增多更显著（P<0.05）；同时间点老年模型组较青年模型组表达较多（P<0.05），两组对照组无明显差异。
　　RT-PCR法结果示在青年、老年两组小鼠中，随时间推移，Snail1及Snail2的表达均呈现先升高后下降的趋势（相较对照组，模型组14d表达量明显增加，28d较14d表达明显减少，P<0.05）。对比两组小鼠同时间点的表达情况，老年模型组较青年模型组于14d增加更为明显，28d减少更为缓慢（P<0.05），两组对照组无明显差异。E-Cadherin模型组14d、28d的表达较对照组减少，且随病程进展，减少更为明显（P<0.05）。相较青年模型组，同时间点老年模型组表达较少（P<0.05），两组对照组无明显差异，与免疫组化结果基本一致。
　　结论：
　　BLM气管内注入诱导小鼠肺纤维化模型成功，同时期老年模型组相较青年模型组肺纤维化及EMT程度更严重，而对照组无明显差异。老年模型组Snail1、Snail2、E-Cadherin较青年模型组变化更为明显。增龄可能通过影响小鼠肺纤维化模型EMT进程中转录因子Snail1、Snail2及其下游调节蛋白E-Cadherin等表达从而加重肺纤维化病变程度。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结 果

2.1 小鼠一般情况及肺组织肉眼形态观察

2.2 小鼠肺组织切片HE及Masson染色结果

2.3 小鼠肺组织EMT相关指标免疫组化染色结果

2.4 小鼠肺组织转录因子Snail1、Snail2，E-Cadherin的RT-PCR结果

3 讨 论

3.1 小鼠肺纤维化模型的建立及病理染色

3.2增龄对小鼠肺纤维化模型中EMT的影响

3.3 增龄对小鼠肺纤维化模型中Snail的影响

3.4 总结与展望

4 结 论

参考文献

综述:Snail介导E-钙粘蛋白沉默的研究进展

致谢

个人简历