胆固醇对体外大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响研究

摘要

目的：
　　通过低浓度Ⅱ、Ⅳ型胶原酶联合消化法从幼年SD大鼠睾丸中分离出睾丸间质细胞（LCs），在含不同浓度的胆固醇的培养基中进行培养，探讨体外不同浓度的胆固醇对大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响，为临床上进一步预防和治疗性腺功能低下提供理论依据。
　　方法：
　　本研究分为两个部分：第一部分：随机选取健康4周龄雄性SD大鼠12只作为母体，采用低浓度Ⅱ、Ⅳ型胶原酶联合消化法从幼年SD大鼠睾丸中分离出LCs，并对其纯化、培养及鉴定。第二部分：将原代培养的LCs随机分成对照组A及实验组B。对照组A又分为对照组A1和A2，实验组B分为实验组B1、B2、B3和B4。其中对照组A1加入标准培养基2（DMEM/F12培养液、胎牛血清5％、二抗10万U/L，LDL-C1.0ug/ml）；对照组A2，为含有HCG（0.5IU/ml）的标准培养基2；实验组B1：在对照组A1的基础上分别加入低密度脂蛋白胆固醇（lipoprotein cholestero；LDL-C）0.2、0.5、1.0、5ug；实验组B2：在对照组A2的基础上分别加入LDL-C0.2、0.5、1.0、5ug；实验组B3：在对照组A1的基础上分别加入氧化低密度脂蛋白胆固醇（oxidized lipoprotein cholesterol；ox-LDL-C）0.2、0.5、1.0、5ug；实验组B4：在对照组A2的基础上分别加入ox-LDL-C0.2、0.5、1.0、5ug。在培养24h后收取培养液，用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）法测定睾酮，并对数据进行统计学分析。
　　结果：
　　第一部分低浓度Ⅱ、Ⅳ型胶原酶联合消化法分离纯化大鼠睾丸间质细胞
　　1)采用0.1%Ⅱ、Ⅳ型胶原酶联合消化法分离LCs的最佳酶解时间为1h左右。
　　2）利用差速贴壁纯化LCs的最佳贴壁时间为1-2h。
　　3）培养24小时后，3β-HSD免疫荧光染色鉴定LCs，纯度为98.1±1.5%，台盼蓝染色鉴定LCs存活率为97.3±1.6%。
　　4）贴壁后培养12小时内，LCs即达分泌高峰，随培养时间的延长，LCs分泌睾酮的能力逐渐下降。
　　第二部分不同浓度的胆固醇对体外培养大鼠LCs分泌睾酮的影响
　　1）实验组B1中：经统计学分析，与加入0.2ug、1.0ug及5.0ug LDL-C组比较，加入0.5ug LDL-C的培养基中，所含睾酮浓度最高，P<0.05，差异有统计学意义。与对照组A1比较加入0.5ug LDL-C的培养基中睾酮浓度更高，P<0.05，差异有统计学意义。加入0.2ug及1.0ug LDL-C的培养基中睾酮浓度与对照组A1中睾酮浓度比较，P>0.05，差异无统计学意义。加入5ug LDL-C的培养基中睾酮浓度低于对照组A1中睾酮浓度，P<0.05，差异有统计学意义。
　　2）实验组B2中：经统计学分析，加入0.5ug及1.0ug LDL-C的培养基中，所含睾酮浓度最高，两者之间比较，P>0.05，差异无统计学意义，与加入0.2ug及5.0 ug LDL-C的培养基中睾酮浓度比较，0.5ug及1.0ug组，睾酮浓度较高，P<0.05，差异有统计学意义。与对照组A2比较，加入0.2ug、0.5ug及1.0ug LDL-C的培养基中睾酮浓度均显著增高，P<0.05，差异有统计学意义。与对照组A2比较加入5.0ug LDL-C的培养基中睾酮浓度明显降低，P<0.05，差异有统计学意义。
　　3）实验组B3中：与对照组A1比较，加入0.2ug、0.5ug ox-LDL-C的培养基中睾酮浓度均低于对照组A1中睾酮浓度，P<0.05，差异有统计学意义，1.0ug及5.0ug组中睾酮浓度低于0.15ng/ml，低于标准曲线测量范围，测量值可能存在较大误差，故不做比较。
　　4）实验组B4中：与对照组A2比较，加入0.2ug、0.5ug、1.0ug及5ug ox-LDL-C的培养基中睾酮浓度均低于对照组A2，P<0.05，差异有统计学意义，睾酮浓度随加入的ox-LDL-C的增加明显下降。
　　5）实验组B1与实验组B2比较，可见实验组B2中利用LDL-C合成睾酮明显增加，实验组B1中加入0.5ug组，睾酮浓度最高，实验组B2中，0.5ug及1.0ug组睾酮浓度最高，可见实验组B2可利用更高浓度的LDL-C合成胆固醇。
　　结论：
　　通过低浓度Ⅱ、Ⅳ型胶原酶联合消化法可以获得足够多具高活性的高纯度睾丸间质细胞，并且LCs增殖能力较强。适当增加LDL-C浓度可促进体外培养的LCs合成睾酮，过高浓度的LDL-C则会抑制体外培养的LCs合成睾酮；HCG可以加强体外培养的LCs利用胆固醇合成睾酮的能力，增加LCs对高浓度的LDL-C的利用能力；低浓度的ox-LDL-C对体外培养的LCs合成睾酮存在抑制，其抑制能力随浓度的增加而增加。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

第一部分 低浓度Ⅱ、Ⅳ型胶原酶联合消化法分离纯化大鼠睾丸间质细胞

1 材料和方法

1.1实验动物及主要的试剂、仪器

1.2 间质细胞的分离、纯化和原代培养

1.3间质细胞鉴定

1.4间质细胞睾酮分泌活性测定

1.5统计学分析

2 结果

2.1 睾丸湿重

2.2间质细胞原代培养及观察

2.3 酶解时间的选择和确定

2.4差速贴壁时间的选择和确定

2.5 Leydig细胞存活率测定

2.6 Leydig细胞纯度鉴定

2.7 Leydig细胞睾酮分泌活性的检测

3 讨论

4 结论

第二部分 不同浓度的胆固醇对体外培养大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响

1 材料和方法

1.1实验动物及主要的试剂、仪器

1.2 实验方法

1.3统计学分析

2 实验结果

2.1 睾酮测量标准曲线建立

2.2 测量结果

2.3 数据处理

3讨论

4 结论

参考文献

综述:睾丸间质细胞的部分研究进展

致谢

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