血管紧张素-(1-7)通过抑制内质网应激对缺氧/复氧心肌细胞保护作用研究

摘要

目的：
　　在细胞水平探讨Ang-(1-7)是否是通过调节内质网应激途径对心肌细胞H/R损伤起保护作用的，以及是否是作用于其特异性受体Mas来发挥此作用的。
　　方法：
　　1.H9C2细胞培养、传代、冻存；建立心肌细胞H/R模型；
　　2.分别给予Ang-(1-7)或（和）A-779干预，即：（1）Control组：无干预；（2） H/R组：先缺氧3小时，再复氧6小时；（3）Ang-(1-7)+H/R组：缺氧复氧前30分钟给予1000nM Ang-(1-7)孵育，后再缺氧3小时，复氧6小时；（4）Ang-(1-7)+A-779+H/R组：缺氧复氧前1小时给予1000nMA-779，缺氧复氧前30分钟给予1000nM Ang-(1-7)孵育，后再缺氧3小时，复氧6小时；（5）A-779+H/R组：缺氧复氧前1小时给予1000nMA-779，后再缺氧3小时，复氧6小时。
　　3.检测心肌细胞凋亡、检测细胞上清液心肌酶、检测心肌细胞内质网应激相关指标，研究Ang-(1-7)对心肌细胞缺血再灌损伤的保护作用及其作用机制。
　　结果：
　　1.上清液 CK-MB含量(ng/ml）：分别为429.11±260.55、1145.87±58.50、601.94±153.38、1081.88±184.39、1085.65±134.28。与control组相比，H/R组的CK-MB的含量明显增加（P<0.01），Ang-(1-7)+H/R组的CK-MB的含量增加（P<0.05）， Ang-(1-7)+A-779+H/R组的CK-MB的含量明显增加（P<0.01），A-779+H/R组的CK-MB的含量明显增加（P<0.01）；于H/R组相比，Ang-(1-7)+H/R组的CK-MB的含量减少（P<0.05），Ang-(1-7)+A-779+H/R组的CK-MB的含量差异无统计学意义（P＞0.05），A-779+H/R组的CK-MB的含量差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　2. Caspase-3分光光度法检测细胞凋亡：各组凋亡细胞的相对OD值,分别为2.07±0.18、2.66±0.14、2.13±0.09、2.59±0.29、2.59±0.15。与control组相比，H/R组的相对OD值增加（P<0.01），Ang-(1-7)+H/R组的相对OD值增加（P<0.05）， Ang-(1-7)+A-779+H/R组的相对OD值增加（P<0.01），A-779+H/R组的相对OD值增加（P<0.01）；于H/R组相比，Ang-(1-7)+H/R组的相对OD值减少（P<0.05）， Ang-(1-7)+A-779+H/R组的相对OD值差异无统计学意义（P＞0.05），A-779+H/R组的相对OD值差异无统计学意义（P＞0.05）
　　3.Western blot检测凋亡相关蛋白
　　3.1 Bcl-2蛋白在各组细胞中的表达分别为（×10-2）：6.16±0.74、2.21±0.60、3.59±0.38、2.38±0.72、2.41±0.70，与control组相比， H/R组的表达量明显减少（P<0.01），Ang-(1-7)+H/R组的表达量减少（P<0.01），Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量减少（P<0.01），A-779+H/R组的表达量减少（P<0.01）；与H/R组相比， Ang-(1-7)+H/R组的表达量增加（P＜0.05），Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05），A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05）；
　　3.2 Bim蛋白在各组细胞中的表达分别为（×10-2）：7.47±0.54、13.02±0.85、10.28±0.74、13.85±2.4、12.58±1.96，与control组相比，H/R组的表达量增加（P<0.01）， Ang-(1-7)+H/R组的表达量增加（P＜0.05），Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量增加（P<0.01），A-779+H/R组的表达量增加（P<0.01）；与H/R组相比，Ang-(1-7)+H/R组的表达量减少（P＜0.05），Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05），A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05）；
　　4.Western blot检测内质网应激相关蛋白
　　4.1 GRP78蛋白在各组细胞中的表达分别为（×10-2）：197.57±15.27、258.96±30.29、194.13±18.75、268.89±24.92、268.13±53.00，与control组相比，H/R组的表达量增加（P<0.01），Ang-(1-7)+H/R组的表达量差异无统计学意义（P＞0.05）， Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量增加(P<0.01）， A-779+H/R组的表达量增加(P<0.01）；与 H/R组相比， Ang-(1-7)+H/R组的表达量减少(P＜0.05），Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05），A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05）；
　　4.2 CHOP蛋白在各组细胞中的表达分别为（×10-2）：23.52±5.68、60.32±11.34、42.57±7.62、63.05±6.65、65.46±4.41，与control组相比，H/R组的表达量增加（P<0.01）， Ang-(1-7)+H/R组的表达量增加（P＜0.05），Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量增加（P<0.01），A-779+H/R组的表达量增加（P<0.01）；与H/R组相比，Ang-(1-7)+H/R组的表达量减少（P＜0.05），Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05），A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05）；
　　4.3 Caspase12蛋白在各组细胞中的表达分别为（×10-2）：46.32±10.12、95.87±13.94、68.71±10.89、84.19±12.24、100.28±14.58，与control组相比，H/R组的表达量增加(P<0.01）， Ang-(1-7)+H/R组的表达量增加(P＜0.05）， Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量增加(P<0.01）， A-779+H/R组的表达量增加(P<0.01）；与 H/R组相比， Ang-(1-7)+H/R组的表达量减少(P＜0.05）， Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05），A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05）；
　　4.4 JNK蛋白在各组细胞中的表达分别为（×10-2）：28.02±6.74、72.07±9.36、48.31±10.05、74.03±18.30、68.74±9.26，与control组相比， H/R组的表达量增加（P<0.01），Ang-(1-7)+H/R组的表达量增加（P＜0.05），Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量增加（P<0.01），A-779+H/R组的表达量增加（P<0.01）；与H/R组相比，Ang-(1-7)+H/R组的表达量减少（P＜0.05），Ang-(1-7)+A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05），A-779+H/R组的表达量的差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　本课题为国家自然科学基金“血管紧张素-(1-7)抑制内质网应激对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究（编号：81570273）”。
　　结论：
　　1.Ang-(1-7)通过抑制内质网应激—凋亡通路对MIRI起保护作用。2.Ang-(1-7)通过其特异性受体Mas受体发挥上述作用。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞

1.1.2 实验试剂

1.1.3 实验常用溶液

1.1.4 实验常用设备

1.2 实验方法

1.2.1 H9C2培养与传代

1.2.2 H9C2心肌细胞的冻存与复苏

1.2.3 种植6孔板/60cm培养皿

1.2.4 实验分组

1.2.5 总蛋白提取及其含量的测定（Bradford法测蛋白浓度）

1.2.6 Caspase-3分光光度法检测细胞凋亡

1.2.7 大鼠肌酸激酶同工酶（CK-MB）测定

1.2.6 Western blot 检测

1.3 统计学处理

2 实验结果

2.1 大鼠心肌细胞肌酸激酶同工酶（CK-MB）测定

2.2 Caspase-3分光光度法测定Ang-(1-7)对H/R心肌细胞的凋亡的影响

2.3 Western Blot

2.3.1 Western Blot法检测凋亡相关蛋白

2.3.2 Western Blot法检测内质网应激相关蛋白

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述：ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴与心血管疾病

致谢

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