胆碱-聚乙二醇双修饰蒿甲醚脂质纳米粒的制备及其体内外药效与初步靶向性研究

摘要

目的：
　　感染疟原虫的红细胞会特异性表达生成新渗透性通道（NPPs），并在红细胞膜上过表达胆碱转运载体(ECCs）。基于此，本课题以胆碱-聚乙二醇衍生物（CD-PEG-SA）为修饰分子，构建粒径＜80 nm的胆碱-聚乙二醇双修饰蒿甲醚脂质纳米粒（CD-PEG-ARM-NLC），以期靶向红细胞膜上的NPP通道和ECC载体，达到长循环和靶向抗疟的作用。制备并表征CD-PEG-ARM-NLC；考察其对约氏疟原虫（PyBY265）、恶性疟原虫（Pf3D7）的体内外抗疟活性；并通过包载荧光探针香豆素-6研究CD-PEG-NLC对感染红细胞的靶向性。
　　方法：
　　1. CD-PEG-ARM-NLC的处方工艺考察
　　在前期工艺研究基础上，采用高压乳匀法制备CD-PEG-ARM-NLC，通过对CD-PEG-SA的加入方式、用量进行单因素考察，优化制备处方。
　　2. CD-PEG-ARM-NLC的质量表征
　　对CD-PEG-ARM-NLC的形状、粒径、Zeta电位、包封率、载药量等理化性质进行表征，考察药物的体外释放特性，并进行体外溶血试验。
　　3. CD-PEG-ARM-NLC的体外抗疟活性评价
　　通过明胶沉降法从常规培养的Pf3D7中分离得到有/无knob结构的Pf3D7，以ARM为阳性对照，采用常规培养的、有/无knob结构的Pf3D7，应用SYBR Green I法，考察不同浓度的ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC对疟原虫增殖的抑制作用，以药物的半数抑制浓度（IC50）为指标考察其体外抗疟活性。
　　4. CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察
　　以香豆素-6（C6）为荧光探针，C6溶液为阳性对照，高压乳匀法制备C6-NLC、PEG-C6-NLC、CD-PEG-C6-NLC。将荧光纳米粒分别与体外培养的Pf3D7感染的红细胞、在体PyBY265感染的疟鼠红细胞孵育，荧光显微镜下观察荧光分布和强度。通过NPP通道和ECC载体抑制试验，比较不同纳米粒组的荧光亮度，分析NPP通道和ECC载体对纳米粒进入感染红细胞的影响。
　　5. CD-PEG-ARM-NLC的体内药效学研究
　　采用约氏疟原虫BY265感染小鼠模型，以溶剂组、三种空白纳米粒组，不治疗（空白）组为阴性对照，以ARM组为阳性对照，通过四天抑制试验和28天治愈试验考察ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC三种纳米粒的抗疟活性。
　　结果：
　　1. CD-PEG-ARM-NLC考察后处方
　　CD-PEG-SA的加入方式为外加乙醇法，加入量为m胆碱/m混脂=19.24％（g/g）。考察后的处方组成为：GMS1.9286 g，MCT1.0714 g，RH401.2 g，ARM0.768 g， CD-PEG-SA0.5772 g，去离子水100 ml。
　　2. CD-PEG-ARM-NLC的质量表征
　　CD-PEG-ARM-NLC是均一、略带蓝色乳光的半透明液体制剂，透射电镜结果显示纳米粒呈类球形，粒径分布均匀；测定平均粒径为65.10±0.64 nm，多分散系数为0.186±0.004；Zeta电位为-24.47±1.01 mV；包封率为87.03%±0.71%；载药量为11.62%±0.10%；在pH7.4的磷酸盐缓冲液中72 h内体外累积释放率为81.95%±0.85%，释药规律符合Weibull方程，t50为10.36 h；体外溶血试验无红细胞聚集及溶血现象。
　　3. CD-PEG-ARM-NLC的体外抗疟活性评价
　　SYBR Green I法测得ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC对常规培养的Pf3D7的IC50值分别为4.28±0.05、3.69±0.07、3.22±0.05、2.68±0.05 nmol/L；对有knob结构的Pf3D7的IC50值分别为4.32±0.06、3.93±0.03、3.58±0.08、3.01±0.05 nmol/L；对无knob结构的Pf3D7的 IC50值分别为4.27±0.06、3.34±0.07、2.81±0.08、2.12±0.09 nmol/L。
　　4. CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察
　　荧光显微镜观察结果显示，纳米粒基本不进入正常红细胞，但可进入感染红细胞，且能聚集于疟原虫周围，而不是弥散于整个红细胞；CD-PEG-C6-NLC组的荧光强度高于C6-NLC组和PEG-C6-NLC组；以上结果显示CD-PEG-C6-NLC对感染红细胞有靶向作用。加入NPP抑制剂（呋塞米）可基本阻断C6-NLC和PEG-C6-NLC进入感染红细胞，但CD-PEG-C6-NLC仍可进入感染红细胞；同时加入NPP抑制剂（呋塞米）和ECC天然底物（胆碱）方能基本阻断红细胞对CD-PEG-C6-NLC的摄取。
　　5. CD-PEG-ARM-NLC的体内药效学研究
　　阳性对照组ARM尾静脉注射的ED50值为0.266 mg/(kg·day)，ED90值为0.945 mg/(kg·day)，ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC的ED50值分别为0.245、0.233、0.228 mg/(kg·day)，ED90值分别为0.927、0.905、0.872 mg/(kg·day)，表明ARM制成纳米粒后抗疟活性有一定的提高。
　　结论：
　　采用优化后处方制备CD-PEG-ARM-NLC，其粒径、Zeta电位、包封率、载药量、体外释放特性和溶血试验等指标均符合预期要求；体内外药效实验均说明CD-PEG-ARM-NLC比ARM、ARM-NLC和PEG-ARM-NLC有更好的抗疟活性；靶向试验初步结果表明CD-PEG-C6-NLC对感染红细胞有靶向作用，更深入的验证有待后续实验。
　　本课题为国家自然科学基金“基于代谢机制靶向红细胞内疟原虫的青蒿素类药物纳米递药系统研究（编号：81373364）”。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

第一部分 胆碱-聚乙二醇双修饰蒿甲醚脂质纳米粒的处方工艺考察

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第二部分 胆碱-聚乙二醇双修饰蒿甲醚脂质纳米粒的质量表征

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第三部分 胆碱-聚乙二醇双修饰蒿甲醚脂质纳米粒的体外抗疟活性评价

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第四部分 载香豆素-6的胆碱-聚乙二醇双修饰脂质纳米粒体外靶向性的初步考察

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第五部分 胆碱-聚乙二醇双修饰的蒿甲醚脂质纳米粒的体内药效研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述:抗疟药靶向递送载体的研究进展

致谢

在学期间承担/参与的科研课题与研究成果

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