白杨素对氧化应激诱导的血管内皮损伤的保护作用

摘要

目的：
　　1.观察白杨素急性给药是否可以减轻H2O2所致的HUVEC氧化应激损伤；
　　2.观察白杨素是否可以减轻高糖导致的HUVEC损伤和改善高糖损伤的大鼠离体主动脉舒张反应性。
　　方法：
　　1.（1）培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），用H2O2（100~1000μM）处理2 h，通过MTT实验及细胞培养液中LDH的检测，观察不同浓度H2O2对细胞活力及膜
　　稳定性的影响，选取最适浓度作为造模浓度；常规培养HUVEC细胞，分为正常对照组（control）、H2O2损伤组（H2O2）及不同浓度白杨素处理组（25μM、50μM、100μM），检测各组细胞活力以及细胞膜稳定性；（2）测定各组HUVEC细胞内丙二醛（MDA）浓度和超氧化物歧化酶（SOD）活性；（3）用10μM DCEF-DA孵育HUVEC30 min，荧光显微镜拍照分析各组细胞内活性氧簇（ROS）的量；（4）采用Griess法检测各组细胞内一氧化氮（NO）的释放；（5）采用比色法检测各组HUVEC细胞内一氧化氮合酶（NOS）活性；（6）采用RT-PCR法检测各组HUVEC细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平；（7）采用Western Blot法检测各组HUVEC细胞eNOS蛋白表达水平。
　　2.（1）培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），通过MTT实验观察不同浓度葡萄糖（11.1 mM、22.2 mM、33.3 mM、44.4 mM）对HUVEC细胞活力的影响并选择适当浓度时间建立高糖损伤模型；培养HUVEC细胞，分为正常糖浓度组（normal glucose, NG）、高糖组（high glucose, HG）、甘露醇对照组（mannitol, MNT）、白杨素干预组（25μM、50μM、100μM），检测各组细胞活力；DCEF-DA预孵30 min，荧光显微镜拍照分析各组活性氧簇（ROS）量；通过Griess法检测各组细胞内皮释放NO的功能；采用比色法测定各组HUVEC细胞内NOS活性；（2）采用大鼠离体主动脉血管环，通过检测ACh诱导的内皮依赖性舒张反应性观察高浓度葡萄糖对血管内皮的损伤作用以及白杨素的干预作用。
　　结果：
　　1.不同浓度的H2O2（100~1000μM）处理2 h后，随着H2O2浓度的升高HUVEC细胞存活率逐渐降低。当浓度达400μM时，细胞存活率为（65.73±4.06）％，与control组相比有显著性差异（P<0.01）；
　　2.不同浓度白杨素（25μM、50μM、100μM）预处理12 h后，细胞存活率分别增至（71.94±4.68）％、（82.17±4.65）％、（86.24±3.44）％，在50μM、100μM时与H2O2损伤组相比具有显著性差异（P<0.01）；
　　3. H2O2处理2 h后，细胞内MDA含量升高，浓度为（8.23±0.09）μM；而SOD活力显著降低，活性为（0.59±0.07）U/mgprot，与 control组相比有统计学差异（P<0.05）；白杨素（25μM、50μM、100μM）预处理12 h后，MDA含量显著降低，分别降至（7.91±0.09）μM、（7.65±0.16）μM、（7.63±0.18）μM，与H2O2损伤组相比有显著性差异（P<0.01）；SOD活性与H2O2损伤组相比显著升高，并且在浓度为50μM、100μM时有显著性差异（P<0.01），分别为（0.79±0.06）U/mgprot和（1.37±0.04）U/mgprot；
　　4. H2O2处理2 h后，细胞内ROS生成增多，而不同浓度白杨素（25μM、50μM、100μM）预处理12 h后，与H2O2损伤组相比，ROS产生减少；
　　5. H2O2处理2 h后，细胞内NO释放量显著降低，浓度为（9.09±0.55）μM，与control组相比有显著性差异（P<0.01）；白杨素（25μM、50μM、100μM）预处理12 h后，NO释放量与H2O2损伤组相比增加，并且在50μM、100μM时，有显著性差异（P<0.01），释放量分别为（10.97±0.65）μM、（11.43±0.85）μM；
　　6. HUVEC细胞在H2O2处理2 h后，胞内总一氧化氮合酶（TNOS）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性同时降低，活力分别为（0.81±0.01）U/mgprot、（0.05±0.05） U/mgprot；而诱导性一氧化氮合酶（iNOS）活性升高，活力为（0.82±0.16）U/mgprot，与control组相比具有显著性差异（P<0.01）；而白杨素（25μM、50μM、100μM）预处理12 h后，胞内总一氧化氮合酶（TNOS）活性升高，活力分别增至（0.97±0.10） U/mgprot、（1.09±0.12）U/mgprot和（1.12±0.13）U/mgprot，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性同时升高，活力分别为（0.20±0.09）U/mgprot、（0.38±0.12）U/mgprot和（0.41±0.13）U/mgprot，而诱导性一氧化氮合酶（iNOS）活性降低，活力分别为（0.84±0.09）U/mgprot、（0.70±0.10）U/mgprot和（0.71±0.03）U/mgprot，与H2O2
　　损伤组相比具有显著性差异（P<0.01）；
　　7. RT-PCR检测结果显示，H2O2损伤2小时，HUVEC细胞黏附分子VCAM-1、ICAM-1的 mRNA增加，不同浓度白杨素预孵育12 h，HUVEC细胞内粘附分子VCAM-1、ICAM-1的mRNA表达降低；
　　8. Western blot实验结果显示，H2O2损伤2小时，HUVEC细胞eNOS蛋白表达量下降，不同浓度白杨素预处理HUVEC细胞12 h后，eNOS蛋白表达量增加，与H2O2损伤组相比有统计学差异（P<0.05）；
　　9.高糖（HG，glucose33.3 mM）孵育48 h后，细胞存活率降为（82.56±3.97）%，与 NG组相比有显著性差异（P<0.01）；而甘露醇对照组（MNT, glucose5.5mM+mannitol27.8 mM）与NG组相比无显著性差异；白杨素（25μM、50μM、100μM）预处理2 h后，细胞存活率显著升高，分别为（103.40±4.78）%、（107.60±11.58）%和（121.80±7.40）%，与HG损伤组相比有统计学差异（P<0.01）；
　　10.高糖（HG，glucose33.3 mM）孵育48 h后，胞内ROS增多，而白杨素（25μM、50μM、100μM）预处理2 h后，胞内ROS减少；
　　11.高糖（HG，glucose33.3 mM）孵育后，细胞内NO含量降至（2.63±0.38）μM，与NG组相比有统计学差异（P<0.05）；而甘露醇对照组（MNT, glucose5.5 mM+mannitol27.8 mM）与NG组相比无显著性差异；不同浓度白杨素预处理2 h后，胞内 NO含量增加，在浓度为50μM、100μM时与 HG损伤组相比有统计学差异（P<0.05），分别为（4.03±0.69）μM、（4.07±0.98）μM；
　　12. HUVEC细胞在高糖（HG，glucose33.3 mM）孵育48 h后，胞内总一氧化氮合酶（TNOS）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性同时降低，活性为（1.10±0.07） U/mgprot、（0.01±0.18）U/mgprot；而诱导性一氧化氮合酶（iNOS）活性升高，活性为（1.10±0.23）U/mgprot，与NG组相比具有统计学差异（P<0.05）；MNT组与NG相比没有显著性差异；白杨素（25μM、50μM、100μM）预处理后，胞内总一氧化氮合酶（TNOS）活性升高，活性分别为（1.35±0.31）U/mgprot、（1.66±0.38） U/mgprot和（1.71±0.25）U/mgprot；内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性同时升高，活性分别为（0.22±0.58）U/mgprot、（0.70±0.25）U/mgprot和（1.03±0.37）U/mgprot；而诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性降低，活性分别为（1.13±0.29）U/mgprot、（0.96±0.13）U/mgprot和（0.69±0.15）U/mgprot；与 HG损伤组相比具有统计学差异
　　（P<0.05）；
　　13.大鼠离体主动脉血管环在高糖（HG, glucose44.4 mM）孵育4 h后，ACh诱导的内皮依赖性舒张功能减弱，Emax和EC50为（31.78±3.36）%，81.10μM，与NG组相比有显著性差异（P<0.01）；而 SNP诱导的非内皮依赖性舒张与 NG组相比无显著性差异；给予白杨素（1.0μM）急性处理30 min后可改善ACh诱导的内皮依赖性舒张反应性，Emax和EC50分别为（70.53±3.69）%，1.05μM，与HG组相比有显著性差异（P<0.01）。
　　结论：
　　1.白杨素可以减轻H2O2诱导的HUVEC细胞氧化应激损伤，增加内皮舒张因子NO的生成；
　　2.白杨素可以减轻高糖引起血管内皮氧化应激损伤，增强内皮依赖性舒张反应性。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

第一部分 白杨素对H2O2诱导的HUVEC氧化应激损伤的影响

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1不同浓度H2O2对HUVEC细胞存活率和胞内LDH释放影响

2.2 各组HUVEC细胞存活率和胞内LDH释放量

2.3 各组HUVEC细胞内MDA浓度与SOD活性

2.4 各组HUVEC细胞胞内ROS量

2.5各组HUVEC细胞胞内NO浓度测定

2.6 各组HUVEC细胞胞内NOS活性测定

2.7 各组HUVEC细胞胞内VCAM-1、ICAM-1 mRNA 水平

2.8 各组HUVEC细胞内eNOS蛋白表达量

3 讨论

4 结论

第二部分 白杨素对高糖诱导血管内皮损伤和舒张功能失常的影响

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1不同浓度高糖对HUVEC细胞存活率的影响

2.2 各组HUVEC细胞存活率检测

2.3 各组HUVEC细胞胞内ROS量

2.4 各组HUVEC细胞内NO浓度及NOS活性测定

2.5 各组大鼠离体主动脉内皮依赖性舒张反应性

3 讨论

4 结论

综述:糖尿病并发症及白杨素干预作用的研究进展

致谢

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