花生与其近缘野生种间体细胞杂交法的基础研究

摘要

花生是重要的油料兼经济作物，但由于花生易受多种病虫害以及干旱等灾害的影响，导致其产量和品质严重下降。花生近缘野生种具有抗病、抗逆性强，生物产量高，品质优良等遗传基因，但由于花生与其近缘野生种存在的种间杂交不亲和等原因，严重限制了野生资源的有效利用。体细胞杂交法能够克服这种杂交不亲和性，使野生种的利用成为可能。而体细胞杂交法能否成功应用依赖于高频率植株再生体系的建立。该项研究首先对花生及其近缘野生种组织培养植株再生方法进行研究，建立了高频率植株再生体系，在此基础上对原生质体培养和细胞融合进行了研究。 1.对33个花生品种(品系)的不同外植体和利用不同培养基诱导不定芽分化及植株再生进行研究，结果表明：(1)基因型对再生率有很大的影响，不同基因型的不定芽分化率有明显差异。(2)花生不同外植体分化不定芽的频率有很大的差异，幼叶明显优于上胚轴、下胚轴和子叶。(3)诱导培养基中添加NAA和BAP的浓度不同对以后再分化培养基上不定芽分化有较大影响。(4)对花生不定芽诱导的条件进行优化，筛选出比较适合花生不定芽诱导分化及植株再生的培养基组合为：不定芽诱导培养基为MSB5+1mg/LNAA+6mg/LBAP+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％琼脂；植株再生培养基为MSB5+4mg/LBAP+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％琼脂；生根培养基为MSB5+0.5mg/LNAA+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％琼脂。 2.对花生及其近缘野生种胚性愈伤组织和体胚诱导进行研究表明：野生种胚性愈伤组织形成培养基为MSB5+10mg/L2,4D+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％琼脂。栽培种胚性愈伤组织或体胚的诱导培养基为MSB5+15mg/L2,4D+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％琼脂，体胚萌发及植株再生培养基为MSB5+4mg/LBAP+4mg/LAgNO3+600mg/LCH+3％蔗糖+0.8％琼脂。 3.建立了悬浮细胞系，花生区组野生种A.chacoensis胚性愈伤组织在添加15mg/L2,4D、4mg/LAgNO3、600mg/LCH、0.5％PVP和3％蔗糖的MSB5液体培养基中能很好的增殖，在液体培养基中继代培养5-6代后可形成稳定的胚性悬浮细胞系(继代周期为7天)。 4.对花生原生质体分离与培养条件进行研究。材料在含有CellulaseONOZUKARS(纤维素酶，2.0％)和PectolyaseY-23(果胶酶，0.1％)的酶液中，酶解处理6-7小时，酶解液中可观察到大量游离原生质体，经纯化处理后培养在添加1mg/LNAA和6mg/LBAP的固液双层培养基中，3天后可观察到细胞分裂，以后细胞继续分裂。已得到8823、鲁花14和白沙果等原生质体分裂形成的愈伤组织。 5.对花生与其近缘野生种间细胞融合及培养方法进行研究。将栽培种8823体胚与匍匐区组近缘野生种A.rignoii嫩茎分离的原生质体，用PEG法融合后，在添加1mg/LNAA、6mg/LBAP、4mg/LAgNO3、600mg/LCH和3％蔗糖的MSB5培养基上进行双层培养，2-3天后观察到细胞分裂，后形成细胞团，8周左右，形成直径达1-2mm左右的愈伤组织。

目录

文摘

英文文摘

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致谢

一、前言

1花生生产的意义

2花生育种的研究进展

2.1花生常规育种及其存在的问题

2.2花生属近缘野生种的优点及其应用前景

2.3花生组织培养研究进展

2.4花生原生质体培养及融合的研究进展

3本研究的目的与内容

二材料与方法

1花生幼叶不定芽诱导及植株再生

1.1供试材料

1.2方法

2.花生幼叶体细胞胚胎形成及植株再生

2.1供试材料

2.2方法

3花生胚性愈伤的悬浮培养

3.1供试材料

3.2方法

4花生原生质体分离与培养

4.1供试材料

4.2方法

5花生原生质体融合与培养

5.1供试材料

5.2方法

三结果与分析

1花生幼叶不定芽分化及植株再生

1.1培养基对花生种子萌发的影响

1.2 NAA和BAP对幼叶不定芽诱导的影响

1.3不同浓度AgNO3对花生幼叶不定芽分化的影响

1.4 CH(水解蛋白)对花生幼叶不定芽诱导的影响

1.5不同基因型对花生幼叶不定芽发生的影响

1.6植株再生

1.7驯化移栽

2花生幼叶体细胞胚胎诱导及植株再生

2.1花生不同外植体对体胚诱导的影响

2.2 2,4-D或毒锈啶对体胚诱导的影响

2.3不同基因型花生对体胚的诱导的影响

2.4植株再生

3花生胚性愈伤的悬浮培养

3.1胚性愈伤悬浮系的培养

3.2抗褐变剂对悬浮培养的影响

3.3 2,4-D浓度对悬浮培养的影响

4花生及其近缘野生种原生质体的分离与培养

4.1花生原生质体的分离

4.2原生质体培养及愈伤组织的形成

5花生原生质体的融合与培养

5.1原生质体的分离与融合

5.2融合处理后原生质体的培养

四讨论

1影响花生组织培养高频率植株再生因素的研究

1.1外植体对不定芽发生的影响

1.2基因型对不定芽和体胚发生的影响

1.3激素配比对不定芽和体胚发生的影响

1.4不同添加物对不定芽发生的影响

1.5花生胚性愈伤的悬浮培养

2影响花生原生质体分离与培养的因子

3花生原生质体的融合与培养

五结论

参考文献

附录 A.缩略语