HIGS技术应用于棉花黄萎病防控的探索

摘要

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）是重要的土传病原菌之一，引起多种重要经济作物的黄萎病，给世界棉花生产造成了严重危害。目前防控黄萎病的手段主要有化学防治、轮作倒茬、生物防治、选育抗病品种等。虽有一定成效，但由于黄萎病菌抗逆性强，多有变种，且致病机理复杂，导致这一病害难以根治。寄主诱导的基因沉默（Host-induced gene silencing，HIGS）是以RNAi为基础的，在寄主植物中产生siRNA(small interfering RNA)，随后进入病原体体内发挥作用，从而特异性沉默病原体基因的一种新技术，在植物与病原菌（病毒、线虫、细菌、卵菌、真菌）互作中已经广泛应用，并取得很多成果,可能对棉花黄萎病的防治也有重要作用。为此，我们希望利用HIGS技术沉默黄萎病菌的生长发育或致病相关基因，进而达到防治黄萎病的目的。
　　本研究以大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）基因组信息作为依据，通过文献查找，初步挑选了9类共91个大丽轮枝菌生长发育相关或致病相关基因作为备选基因，并挑选棉花的ChlI(黄化基因)、CLA1(白化基因)作为阳性对照基因，棉花材料选用陆地棉（Gossypium hirsutum L.）感黄萎病品种新陆早7号，载体选用棉花皱缩病毒(CLCrV)。分别进行了以下实验：
　　1.利用CLCrV介导的HIGS载体沉默棉花体内大丽轮枝菌中的备选基因。将构建好的93个 HIGS载体转入根癌农杆菌中，利用农杆菌侵染法接种棉花，之后进行大丽轮枝菌的接种，接种后持续观察棉花发病情况。
　　2.从91个目的基因中挑选11个可能在大丽轮枝菌致病性中发挥重要作用的基因进行siRNAs实验，每个基因设计两个siRNAs，分别进行体外抑菌实验和棉花体内的抑菌实验，研究这些基因在大丽轮枝菌侵染棉花中的作用。
　　本实验主要结论如下：
　　1.分别采用蘸根法、灌根法、茎注射法对陆地棉新陆早7号进行人工接菌，孢子悬浮液浓度均为1.0×106个孢子/mL，最终发现茎注射法接种强度适中，发病情况均一，利于筛选本实验中相对抗性植株；
　　2.利用棉花皱缩病毒(CLCrV)为中间载体成功构建了91个可能与黄萎病菌致病相关的基因载体，以及棉花中叶绿素相关基因ChlI(黄化基因)和CLA1(白化基因)的载体。成功沉默了棉花体内的ChlI和CLA1基因，棉花叶片分别出现黄化和白化表型，证明了由CLCrV介导HIGS瞬时沉默载体在棉花体内可以成功应用；
　　3.为了更好地探究目的基因在病原菌与植物互作中的作用，我们从初步筛选并构建成功的91个目的基因载体中，选出可能在大丽轮枝菌生长发育中有重要作用的11个基因，进行深入研究。分别是根部特异表达基因5个，Vd17、Vd19、Vd22、Vd32、Vd155，效应子相关基因3个，Vd64、Vd66、Vd68，cAMP相关基因3个，Vd86、Vd87、Vd89。每个基因设计并合成了2个长度为21nt的siRNAs；
　　4.将11个目的基因进行siRNAs体外抑菌实验。将大丽轮枝菌孢子悬浮液浓度调整至106 mL-1，在106 mL-1孢子悬浮液中添加siRNAs至终浓度为5μM，将孢子悬浮液浓度调整为1×103mL-1之后在MM培养基点板培养。与阳性对照和接种含有UR-siRNA的V991组比较发现，接种含目的基因siRNA的黄萎病菌的菌落生长状况并无显著差异，菌落直径经测量也无显著差异。
　　5.将11个目的基因进行siRNAs棉花体内抑菌实验。于1×106mL-1的孢子悬浮液中添加siRNA至终浓度为5μM，采用茎注射法接种棉花植株。通过调查病情及表型观察发现，与阳性对照和接种携带UR-siRNA孢子悬浮液组比较，这11个携带目基因的siRNAs的孢子悬浮液接种棉花后发病情况不均一，病情指数差异并不显著。这说明，利用HIGS技术无法在棉花体内沉默大丽轮枝菌致病或生长发育相关基因。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

英文缩略表

目录

1 绪论

1.1棉花黄萎病

1.1.1 棉花黄萎病的危害

1.1.2 棉花黄萎菌的生理学特性

1.1.3黄萎病的致病机制

1.2防治黄萎病的策略

1.3寄主诱导的基因沉默（Host-induced gene silence）

1.3.1 HIGS的分子机制

1.3.2 HIGS技术的应用及发展前景

1.4本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料与仪器

2.1.1 材料

2.1.2 试剂与仪器

2.2 实验方法

2.2.1 棉花材料的培养

2.2.2 病原菌培养及接种方法

2.2.3 HIGS载体的构建

2.2.4 HIGS接种

2.2.5大丽轮枝菌接种及病情调查

2.2.6 siRNA实验

3 结果与分析

3.1基因的挑选

3.2 HIGS载体的构建

3.3构建成功的HIGS载体

3.4不同接菌方法对感病品种新陆早7号的影响

3.5阳性对照基因验证HIGS体系

3.6 siRNA实验

3.6.1 siRNAs目的基因的功能注释

3.6.2体外添加siRNA对大丽轮枝菌V991生长的影响

3.6.3棉花体内注射经过siRNA处理的V991对棉花生长的影响

4 讨论

5结论

致谢

参考文献

附录A：

附录B：

附录C：攻读硕士期间发表的论文