He-Ne激光和UV-B辐射对小麦叶绿体超微结构及蛋白质组学的影响研究

摘要

叶绿体是植物细胞中极为关键的细胞器之一，被誉为植物细胞进行生命活动的“动力工厂”。那么，对于在逆境胁迫下植物叶绿体在生理、生化等方面变化的研究具有深远的意义。课题组前期工作中，在关于UV-B辐射增强后导致的植物幼苗生物学功能损伤，以及He-Ne激光的抗逆防护效应方面做了大量工作。本研究将在前期研究成果的基础上，以冬小麦（Triticum aestivum L.）幼苗为研究对象，通过室内模拟UV-B辐射增强的环境条件，研究了UV-B辐射增强（10.08KJ/cm2）和低剂量He-Ne激光辐照（λ=632.8nm，5.23mW/cm2 min）对小麦幼苗叶绿体生理及蛋白质组学的影响，以期进一步深入阐明低剂量He-Ne激光处理对增强UV-B辐射后植物叶绿体损伤的修复效应及细胞学机理。该研究成果对于进一步完善He-Ne激光的抗逆防护效应具有重要的理论和实践意义。
　　本研究主要内容包括：⑴增强UV-B辐射会引起小麦幼苗叶绿体发育异常，导致叶绿体形态、超微结构和化学组成发生变化，叶绿体的光合作用效率降低，叶绿素荧光参数改变，低剂量的He-Ne激光辐照有效地缓解了UV-B辐射对小麦幼苗叶绿体产生的胁迫损伤效应。⑵增强UV-B辐射导致小麦叶片发生ROS积累，这是引起细胞毒性和细胞死亡的重要原因之一。这些 ROS产物的形成主要是由于叶绿体受到UV-B胁迫而释放的，He-Ne激光辐照则可以减少小麦叶绿体ROS的释放，降低UV-B胁迫对小麦细胞造成的毒性效应。⑶通过对实验条件的探索与优化，建立了一套适于小麦叶绿体的分离纯化以及叶绿体蛋白质2DE电泳体系的方法，即采用30%，45%，60%蔗糖浓度的密度梯度离心法，获得了完整度与纯度均较高的叶绿体细胞器，TCA-丙酮沉淀法提取叶绿体蛋白后，选用pH4~7的17cm IPG线性预制胶条，上样量300μg/gel，12%SDS-PAGE胶浓度下进行2-DE电泳实验，分别进行了考染和银染显色，得到了分离效果与重复性良好的2-DE图谱。⑷经PDQuest软件分析后识别出400个左右较为清晰的蛋白质点，依据分析结果对30个显著表达差异的蛋白质点进行了MALDI-TOF-MASS肽质量指纹图谱分析，并结合Mascot搜库软件及UniprotKB/Swiss-prot蛋白功能检索，共鉴定出25个差异蛋白，它们主要参与了叶绿体中光合碳代谢、能量代谢以及抗氧化防御等重要生理过程。另外有2个为Uncharacterized protein，经过数据库检索，推测其分子功能与UV响应及防护相关。⑸选取与叶绿体光合、能量代谢以及抗氧化防御生理密切相关的6种蛋白进行Q-PCR，并与蛋白表达水平进行了比较分析。发现这几个蛋白点在转录水平的上、下调变化与其在蛋白表达水平的变化趋势基本一致，进一步验证了蛋白质组学的实验结果。⑹选取分子功能与UV-B防护相关的一个新蛋白，即 UV-B响应蛋白基因（LOC100844138-UVB2）为研究对象，设计引物，进行基因扩增和克隆，成功扩增获得了1752bp的目的基因条带。后期将进一步对目的片段进行测序检测，通过下游工程技术深入研究和验证其生物学功能。

目录

缩略词

1 文献综述

1.1 UV-B辐射对植物生长发育的影响

1.2 He-Ne激光的抗逆防护机制

1.3 植物叶绿体蛋白质组学的研究进展

1.4 植物抗逆机理的研究进展

1.5研究意义及主要研究内容

2 He-Ne激光与增强UV-B辐射后小麦幼苗叶片组织显微结构及叶绿体超微结构变化

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 小结

3 He-Ne激光与UV-B辐射下小麦幼苗叶绿体的光合作用

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 小结

4 小麦幼苗叶绿体蛋白质组学研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 小结

5 差异蛋白基因表达验证与基因克隆

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与分析

5.4 小结

6 讨论

6.1 He-Ne 激光缓解了UV-B辐射增强对小麦叶绿体产生氧化胁迫

6.2 He-Ne激光缓解了UV-B辐射增强对小麦叶绿体光合作用抑制效应

6.3 He-Ne激光加强了小麦幼苗叶绿体能量产生和物质代谢

6.4 He-Ne激光对UV-B辐射增强胁迫下小麦叶绿体胁迫响应与防御蛋白

7 结论

参考文献

附录

致谢