马铃薯印膜蛋白StREMa4基因的克隆及表达分析

摘要

马铃薯（Solanum tuberosum）是我国四大粮食作物之一，栽培面积仅次于小麦、水稻和玉米。但是，病毒性的、真菌性和细菌性的疾病对马铃薯造成了风险极度严重，是限制马铃薯收成的重要作用因子。由于青枯菌（Ralstonia solanacearum）是通过土壤进行传播，因此在植物马铃薯播种之后侵染的速度非常之快，就像它的名字一样，当马铃薯还处于绿色的时候就开始枯萎，所以叫做青枯病。马铃薯青枯病（bacterial wilt）对马铃薯的产业和食用造成非常严重的后果，如果用化学药物进行治疗，一方面对马铃薯食用的安全性产生质疑，另一方面对土壤造成了严重的破坏。而且，青枯菌是一个具有变异周期短的特点的多个菌种的集合，囊括了好几种不同的菌种。
　　对马铃薯患病起到非常重要作用的包括：EPS和胞外蛋白，由一个互相联络的网络调控系统调控所有致病因子的共同作用，它是由1个主要关键的调节控制系统和5个其余的辅助系统构成。各部分系统协调共同起着重要作用，提高或者抑制青枯病细菌的产生与传播，从而对马铃薯植株产生毁灭性的致病作用。所以，研究调节控制马铃薯成长和发育的分子机制起到很大的效果。
　　马铃薯抗病基因或防卫基因的研究对于马铃薯抗病分子育种意义重大。植物特异的印膜蛋白remorin基因已经被证明参与植物防卫反应。植物特有的remorin基因在被子植物、裸子植物，蕨类和苔藓中都有发现，在基本信息已知的植物基因组中均存在大量的remorin基因，并且高度保守，该种蛋白具有多种生物学功能，如信号转导，抑菌抵抗，损伤修复，抵抗环境胁迫等。然而目前关于马铃薯remorin基因的研究仅限于其分布及结构的研究，对于其具体的功能还未报道。
　　本文采用RACE（rapid amplification of cDNA ends）方法，通过给马铃薯接种青枯菌，从马铃薯抗病品种 ED13中，获得一个克隆了基因全长 cDNA的remorin基因StREMa4。把remorin序列分析之后发现，该基因含803bp碱基，具有一个完整的591 bp的开放阅读框，编码197个氨基酸。Remorin表达的蛋白质序列和马铃薯及茄科其他植物共有很大的相似性。使用Real-time PCR方法，将remorin基因诱导之后分析发现，StREMa4基因不止受青枯菌的影响,而且受如茉莉酸（Jasmonic acid）、水杨酸（Salicylic acid）和脱落酸（Abscisic acid）这些外源植物激素的诱导,而且具有特定时间下不间断的起作用，它的诱导表达模式也出现了一定程度的差异。使用原位杂交的方法研究remorin的表达情况，杂交结果表明：remorin表达具在组织内表达的差异性，集中在茎组织和叶组织维管系统的韧皮部表达。结果显示：在马铃薯和青枯病相互作用前期 StREMa4很容易就受到了青枯菌的原因呈现大量表达，接着在72h再次出现高强度的表达，出现了二次上调表达的现象，预测第一次表达可能对第二次起到了促进作用，这种二次上调表达的具体机制需要进一步研究。通过水杨酸、茉莉酸和脱落酸的处理， StREMa4基因Real-Time PCR检测显示为上调，且对脱落酸的反应更为灵敏。原位杂交分析发现 StREMa4基因表达具在组织内表达的差异性，主要存在于茎组织和叶组织的维管束系统中的韧皮部，根中未检测到。
　　进一步探索StREMa4的诱导上调表达的作用机制，以及与StREMa4相互作用的基因和蛋白的探究将在很大程度上拓展我们对于调控马铃薯生长发育的分子机制的认识。我们现有的结果以及下一步更深入的研究有望为马铃薯青枯病抗性的分子机制提供理论基础。

目录

英文缩略表

1绪论

1.1研究背景与意义

1.2研究进展

1.2.1植物与致病菌的发展

1.2.2 Remorin研究进展

1.2.3 Real-timePCR技术研究进展

1.3本论文的研究内容及拟解决的问题

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌种

2.1.3设备

2.2方法

2.2.1实验材料的培养

2.2.2接种

2.2.3平板稀释计数法检测青枯菌在马铃薯中的状况

2.2.4 RNA提取

2.2.5 SMART反转录

2.2.6 cDNA的纯化

2.2.7 cDNA文库的构建

2.2.8克隆remorin基因特异序列

2.2.9 Bioinformatics分析

2.2.10植物激素处理

2.2.11原位杂交

3结果与分析

3.1总RNA质量的检测

3.2 cDNA双链凝胶电泳检测

3.3印膜蛋白（remorin）基因StREMa4的克隆及序列分析

3.3.1核苷酸序列的分析

3.3.2氨基酸一级结构预测、分析

3.3.3 remorin序列的高级结构解析

3.3.4系统进化树的构建

3.4青枯菌诱导的remorin表达模式

3.5非生物激发子诱导的remorin表达模式

3.6 Remorin表达的组织定位

4.讨论

4.1植物激素诱导的remorin基因发生上调表达

4.2基因remorin青枯菌诱导的条件下的防卫反应

5.结论

参考文献

附录 在学期间的研究成果

致谢