粘虫Pax6基因片段的克隆、表达及功能分析

摘要

粘虫Mythimna separata隶属于昆虫纲（Insecta）鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），是一种典型的季节性远距离迁飞害虫，主要危害玉米、小麦和水稻三大粮食作物。除西藏和新疆外，我国各地均有粘虫灾害发生。 迁飞是导致粘虫大范围爆发的主要原因。经变态发育重建的器官在昆虫迁飞中具有重要作用，如复眼和翅膀，这些器官的发生受多种基因的调控。已有研究表明，Pax6基因通过编码转录因子调控果蝇和蟾蜍的细胞增殖、分化与器官的形成。该基因是否调控粘虫胚后发育中器官的重建是值得深究的。本实验根据候选基因法则，以粘虫为研究对象，探究Pax6基因在其胚后发育中的作用，旨在为研究粘虫变态发育和迁飞行为的分子机制提供基础数据，同时也为农业害虫的生物防治提供了新思路。 本研究主要通过RT-PCR技术克隆了粘虫Pax6基因部分片段，建立了该基因在粘虫不同发育时期的表达模式，最后通过RNA干扰技术对Pax6基因进行沉默，验证了Pax6基因在胚后发育中的作用。 （1）克隆获得长699bp的Pax6基因片段，编码233个氨基酸残基。同源性分析表明，其与棉铃虫Pax6基因同源性高达88%，其次为斜纹夜蛾85%，小菜蛾83%。 （2）以EF-1α为内参基因，结合实时荧光定量PCR技术，分析了粘虫不同发育时期Pax6基因表达量的差异，结果表明，Pax6基因在蛹期第2天和第3天的表达量比羽化前其他时期的表达量高。羽化后第一天，表达量迅速升高，显著高于其他时期。 （3）利用RNA干扰技术，验证Pax6基因的功能。将合成的Pax6-dsRNA注射入6龄末期粘虫体内，不同时间取材，测定目的基因mRNA表达量的变化。结果表明，注射后第1、2、3天，处理组（注射Pax6-dsRNA组）的表达量明显低于对照组（注射GFP-dsRNA和注射DEPC水），说明RNA干扰有效地抑制了Pax6基因的表达。对RNA干扰后的粘虫蛹及成虫表型观察，结果发现，33%的幼虫化蛹后头壳不能正常蜕去，待羽化后口器发育畸形，不能伸缩；42%的蛹腹部未能形成坚硬的外壳，羽化后翅膀严重褶皱，并影响飞行能力。因此，推断Pax6基因可能与变态发育中多种器官的重建有关。

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ABSTRACT

1 前言

1.1 粘虫简介

1.1.1 粘虫的生物习性

1.1.2 粘虫在农业上的危害

1.1.3 我国粘虫研究概况

1.2 昆虫变态发育及器官重建概述

1.2.1 昆虫的变态发育概述

1.2 2 复眼的研究进展

1.2.3 翅的研究进展

1.2.4 口器的研究进展

1.3 Pax6基因的研究进展

1.4 RNA干扰研究进展

1.5 研究的目的与意义

1.6.1 研究内容

1.6.2 技术路线

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验试剂

2.2.1 实验所用主要试剂

2.2.2 实验所用溶液的配制

2.3 仪器设备

2.4 生物信息学分析工具

2.5.1 粘虫Pax6基因片段的克隆

2.5.2 粘虫Pax6基因肽段的结构分析

2.5.3 Pax6基因的表达模式分析

2.5.4 Pax6基因的RNAi

3 结果与分析

3.1 粘虫蛹总RNA的检测

3.2.1 粘虫Pax6基因片段的克隆

3.2.2 Pax6基因片段的序列分析

3.3 粘虫Pax6基因的表达模式分析

3.3.1 不同时期提取总RNA的浓度和纯度分析

3.3.2 Pax6基因的时间表达模式

3.4.1 干扰片段引物的验证

3.4.2 dsRNA的合成及浓度测定

3.4.3 dsRNA的注射

3.4.5 RNA干扰对粘虫Pax6基因表达量的影响

3.4.4 RNA干扰对粘虫表型的影响

4 讨论

4.1 对Pax6基因的讨论

4.2 序列克隆的讨论

4.3 对表达模式讨论

4.4 对干扰讨论

5 结论

6 展望

参考文献