陆地棉GhSH1a基因克隆及功能的初步分析

摘要

棉花是重要的经济作物，是天然纤维的主要来源。对棉花基因功能的研究将为其遗传改良提供理论依据。本研究从陆地棉(GossypiumhirsutumL.)cDNA文库中筛选到一个SINA同源基因，命名为GhSH1a。序列分析表明该GhSH1acDNA全长1394bp，拟编码339个氨基酸。GhSH1a蛋白与果蝇SINA和人类SIAH有30％左右的相似性，GhSH1a蛋白与拟南芥中的SINAT5有78％的相似性。SINA(Seveninabsentia)蛋白家族成员的共同结构特征是具有高度保守的N-端C3HC4Ringfinger结构域。SINA蛋白通过这个结构域使靶蛋白质泛素化并随后被蛋白酶体降解，C-端序列具有与其他蛋白结合的功能。 SINA基因最初是在果蝇中克隆到。果蝇的SINA蛋白在眼睛R7感光细胞命运决定过程中起着关键的作用。哺乳动物SIAH1参与细胞的程序性死亡。拟南芥SINAT5具有泛素蛋白连接酶E3活性，弱化生长素信号，控制植株侧根的发育。然而，对棉花SINA同源蛋白功能的研究还未见报道。根据已知SINA蛋白的功能，尤其是拟南芥SINAT5的功能，以及生长素对棉纤维细胞和植物侧根分化和发育的重要调节作用，推测本研究中的GhSH1a可能调控棉花侧根的发育，或影响棉纤维细胞的分化、伸长。 本研究根据GhSH1acDNA的5’-和3’-末端序列设计引物，以棉花基因组DNA为模板扩增出GhSH1a的基因片段，然后将该片段克隆到pGEM-TEasy载体中进行测序。将GhSH1a的基因序列与cDNA序列比较发现，该基因长2631bp，由3个外显子和2个内含子组成。 通过RT-PCR进行组织表达特异分析，发现GhSH1a在根、茎、叶、花、5DPA、10DPA、15DPA的纤维中都有转录；在根、花、5DPA纤维中转录水平稍高。说明GhSH1a蛋白在各种组织中是必需的，而在分化程度较高的组织中有较高水平的表达。因此推断GhSH1a可能与细胞分化有关。 分别以GhSH1acDNA5’-末端212bp和3’-末端451bp序列为探针与基因组DNA酶切片段进行Southernblot杂交分析，结果显示5’-末端的探针杂交的信号条带较少，表明5’-末端序列有较高的特异性；而3’-末端序列杂交的带较多，表明3’-末端序列较保守。表明棉花基因组中至少含有两个GhSH1a同源基因。 为了分析该基因产物在棉花组织发育过程中的功能，构建了可被雌二醇β-estradiol诱导的植物RNA干扰表达质粒pER8-GhSH1a-RNAi。利用农杆菌介导法将GhSH1a-RNAi片段转化到棉花细胞中，以敲除基因组中内源GhSH1a的表达，观察和分析转基因棉株的表型变化。获得了7个GhSH1a-RNAi转基因株系，PCR和Southernblot杂交检测都证明GhSH1a-RNAi稳定整合到棉花基因组中。7个转基因系中有3个育有种子。β-estradiol诱导GhSH1a-RNAi表达的T1代6天无菌苗的侧根比野生型的较长，根系较发达。侧根被剪去之后，转基因无菌苗的侧根再生能力也比野生型的强。根据转基因棉株的这一表型变化初步分析，GhSH1a-RNAi的表达促进侧根的发育，即GhSHla抑制棉花侧根的发育。这说明GhSH1a的功能与拟南芥中的SINAT5抑制侧根发育的功能是一致的。 将对T1代植株的棉纤维表型包括纤维强度和长度等做进一步的研究，以分析GhSH1a-RNAi的表达是否在纤维的发育过程起作用。该研究的意义在于确定GhSH1a是否与棉花纤维的发育或者与根系发育有关，以便通过基因工程改善棉花纤维品质或提高纤维产量，或者得到根系发达的耐旱品种。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：略语表

第一章综述

第二章陆地棉GhSHla基因的克隆和序列分析

第三章GhSHla组织表达水平的RT-PCR分析及同源基因拷贝数的Southern blot杂交分析

第四章pER8-GhSHla-RNAi质粒的构建和农杆菌转化

第五章农杆菌介导pER8-GhSHla-RNAi的棉花遗传转化

第六章转基因再生棉株的Southern blot杂交检测和T1代无菌苗表型的初步分析

参考文献

总结与展望

附录

致谢

承诺书