胰高血糖素样肽-1突变体基因的克隆、表达与生物学活性分析

摘要

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由肠道内分泌细胞——L细胞分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖素，在体内有多种存在形式。人体进餐、口服或静脉注射葡萄糖后L细胞被激活，导致GLP-1被迅速释放入血液中。由于GLP-1对调节餐后葡萄糖水平起重要作用，使得GLP-1由一个生理性肠降血糖素成员迅速地转变为一种具有潜力的治疗糖尿病的多肽药物。 本课题是在已获得重组人源性GLP-1的基础上进行的后续研究，主要涉及GLP-1的生物活性分析和GLP-1突变体基因的克隆、表达及表达产物的纯化，并探索纯化获得的GLP-1突变体的生物学活性。本研究结果不仅可为产业化规模制备GLP-1突变体提供技术路线，而且也为开发GLP-1的临床应用提供资料。课题研究的主要内容包括：(1)、重组GLP-1(7-36)NH<,2>和GLP-1(7-37)体内生物学活性分析；(2)、GLP-1(7-37)突变体基因的克隆及表达载体的构建；(3)、GLP-1(7-37)突变体的分离纯化；(4)、GLP-1(7-37)突变体的生物学活性分析。 方法： 1．正常SD大鼠按18mmol/kg腹腔注射50％葡萄糖，诱发暂时性高血糖动物模型。腹腔注射不同剂量(2μg/100g、4μg/100g、8μg/100g)GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)，间隔取血测定血糖与血浆胰岛素水平。正常SD大鼠按60mg/kg腹腔注射链脲佐菌素，建立实验性1型糖尿病大鼠模型。静脉输注GLP-1(7-36)NH2(1～1.2pmol/kg·min)120min并观察血糖变化。 2．在上述研究基础上，利用定点突变技术改造GLP-1(7-37)基因，将其第2位丙氨酸(Ala)密码子突变为甘氨酸(Gly)密码子(<'2>Ala-<'2>Gly)。PCR扩增GLP-1突变体基因<'2>Gly-GLP-1(7-37)，经酶切克隆于pGEM-7Z(+)载体中，构建pGEM-7Z(+)/<'2>Gly-GLP-1(7-37)克隆载体，双酶切鉴定后把<'2>Gly-GLP-1(7-37)基因定向插入pGEX-4T-3多克隆位点，构建pGEX-4T-3/<'2>Gly-GLP-1(7-37)融合表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，并进行诱导表达。 3．诱导表达的菌体超声破碎后，裂解液用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析纯化，纯化的融合蛋白再经CNBr裂解、Sephadex G-25柱脱盐、QAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析和RP-C<,18>柱脱盐，得到重组突变体蛋白<'2>Gly-GLP-1(7-37)。重组突变体蛋白进一步用Western印迹分析。 4．将重组GLP-1(7-37)和<'2>Gly-GLP-1(7-37)分别与二肽酰基肽酶Ⅳ(dipeptidylpeptidase Ⅳ，DPP Ⅳ)在37℃共同孵育，于不同时间取样，HPLC分析GLP-1(7-37)和<'2>Gly-GLP-1(7-37)抗DPP Ⅳ活性。之后将二者分别以4μg/100g剂量腹腔注射SD大鼠，在不同时间点取血，测定血糖与血浆胰岛素水平。 结果与讨论： 1.腹腔注射4μg/100g、8μg/100g GLP-1(7-36)NH<,2>和GLP-1(7-37)，处理组大鼠的血糖、血浆胰岛素水平与对照组之间的差别具有非常显著性意义(P<0.001)，且呈现一定的量效关系；二者之间促胰岛素分泌和降血糖活性差异无显著性。静脉输注GLP-1(7-36)NH<,2> 60min后，血糖水平(17.04±1.31)mmol/L(P<0.05)，120min后血糖水平(11.98±1.05)mmol/L(P<0.001)。实验结果提示：GLP-1不仅对2型糖尿病，而且对1型糖尿病也具有潜在治疗作用。 2.经双酶切鉴定和测序分析，证明<'2>Gly-GLP-1(7-37)基因已克隆到pGEX-4T-3载体中。SDS-PAGE和凝胶扫描分析，融合蛋白以可溶形式存在，其表达量占菌体总蛋白的23.5％。 3.裂解液用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后得到GST-<'2>Gly-GLP-1(7-37)融合蛋白，融合蛋白经CNBr裂解、Sephadex G-25柱脱盐、QAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析和RP-C<,18>柱脱盐，得到纯度大于98％的重组<'2>Gly-GLP-1(7-37)。Westem印迹分析证实，该突变体可被特异性GLP-1抗体所识别。 4.与DPP Ⅳ孵育4h后，大于90％的GLP-1(7-37)被DPP Ⅳ降解，而85％以上的<'2>Gly-GLP-1(7-37)保持完整，可明显抵抗DPP Ⅳ的降解。与对照组相比，腹腔注射重组GLP-1(7-37)和<'2>Gly-GLP-1(7-37)(4μg/100g)可显著降低血浆葡萄糖水平，并提高血浆胰岛素水平(P<0.001)，且在15、30min时间点<'2>Gly-GLP-1(7-37)的效应高于GLP-1(7-37)(P<0.05)。实验结果表明，第二位发生突变的<'2>Gly-GLP-1(7-37)在体外可抵抗DPP Ⅳ的降解，在大鼠体内具有降血糖活性与促胰岛素分泌功能。

目录

文摘

英文文摘

承诺书

第一部分文献综述

1.1GLP-1的结构与功能

1.2GLP-1的生物活性

1.3GLP-1结构改造概况

1.4GLP-1前景展望

第二部分重GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)体内生物学活性分析

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3结果

2.4讨论

第三部分GLP-1(7-37)突变体基因的克隆及表达载体的构建

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果

3.4讨论

第四部分GLP-1(7-37)突变体的分离纯化

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3结果

4.4讨论

第五部分GLP-1突变体的生物学活性分析

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3结果与讨论

第六部分结论

参考文献

附录

致谢