Glu101在八肋游仆虫中心蛋白构象及生物功能发挥中的作用

摘要

中心蛋白分子量约为20 kDa，属于钙调蛋白超族，含有四个保守的EF-手结构域，每个结构域可结合一个钙离子。它定位于中心体及细胞核、膜间空间等部位，在中心粒的复制和中心基体纤维的收缩中发挥重要作用。突变氨基酸的研究方法被广泛用来考察蛋白中某些重要氨基酸在蛋白构象及生物功能发挥中的作用。其中紫外照射突变法的优点是可以得到大量突变型蛋白，为研究工作提供较多的实验样本。但其突变结果具有不可知性，需要进行系列的筛选工作。定点突变法以其明确的突变位点以及能够得到高纯度突变蛋白等优点而在许多研究工作中被采用。 基于对150多种钙调蛋白超族成员序列的分析，E-helix链的规范序列可以表示为En＄＄nn＄＄n。其中，E表示Glu，n表示疏水性氨基酸，＄表示任意氨基酸。根据达尔文生物进化理论，本研究推测E-helix链起始的Glu可能对centrin的正常构象和功能的发挥起着重要作用。 本文用分子生物学的方法表达、纯化得到了纯度较高的八肋游仆虫中心蛋白(EoCen)，利用定点突变法将EoCen中第三个EF-手E-helix的第一个氨基酸——Glu101突变为Lys，得到突变蛋白E101K。并从以下几方面研究了保守的Glu101对蛋白构象及生物功能发挥的作用。 首先,采用荧光光谱法、紫外-可见分光光度法考察了Glu101的突变对蛋白基本光谱的影响。结果表明保守的Glu101的突变对蛋白的激发、发射光谱和吸收光谱均不产生影响。此外，以Tb<'3+>为荧光探针考察了突变对蛋白金属结合性质的影响。结果表明Glu101的突变大大增强了Tb<'3+>与蛋白第三个EF-手结合位点作用的荧光敏化强度，推测是由于突变使蛋白构象发生变化而导致蛋白该结合位点与Tb<'3+>作用时的荧光敏化增强。说明Glu101对保持蛋白正常的金属结合性质发挥着重要作用。 其次，研究了Glu101的突变对蛋白与稀土离子作用的影响。结果表明稀土离子与蛋白作用时蛋白构象的变化程度远大于钙离子与蛋白的作用。此外，与EoCen相比，Glu101的突变明显增强了E101K与稀土离子作用时的共振光散射强度，说明Glu101对保持蛋白与稀土离子作用时正常的构象变化起重要作用。 最后，考察了Glu101的突变对蛋白与蜂毒素作用的影响。结果表明蛋白与蜂毒素作用时形成1：1复合物，且Glu101的突变对蛋白与蜂毒素的作用影响较小。

目录

文摘

英文文摘

承诺书

第一章中心蛋白简介

§1.1引言

§1.2中心蛋白的结构

§1.3中心蛋白的分类及功能研究概况

1.3.1中心蛋白的分类

1.3.2中心蛋白功能的研究概况

§1.4蛋白性质及构象研究中的突变研究法概述

§1.5本课题的研究背景及意义

参考文献

第二章八肋游仆虫中心蛋白EoCen及突变蛋白E101K的表达、纯化及鉴定

§2.1引言

§2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

§2.3结果与讨论

2.3.1突变蛋白E101K的序列分析

2.3.2表达所得蛋白的鉴定

2.3.3讨论

参考文献

第三章Glu101突变对蛋白光谱性质及其钙结合性质的影响

§3.1引言

§3.2实验部分

3.2.1材料和仪器

3.2.2实验方法

§3.3结果与讨论

3.3.1突变前后蛋白基本光谱性质比较

3.3.2突变前后蛋白金属结合性质的比较

3.3.3TNS研究Glu101的突变对EoCen构象的影响

§3.4结论

参考文献

第四章Glu101突变对蛋白与稀土离子作用的影响

§4.1引言

§4.2实验部分

4.2.1材料和仪器

4.2.2实验方法

§4.3结果与讨论

4.3.1Tb3+对蛋白构象的影响

4.3.2共振光散射法研究稀土离子对蛋白构象的影响

§4.4结论

参考文献

第五章Glu101突变对蛋白与蜂毒素作用的影响

§5.1引言

§5.2实验部分

5.2.1材料和仪器

5.2.2实验方法

§5.3结果与讨论

5.3.1Ca2+对蛋白与蜂毒素作用的影响

5.3.2Tb3+对蛋白与蜂毒素作用的影响

§5.4结论

参考文献

第六章论文总结与待完成工作

§6.1论文总结

§6.2待完成工作

附录

致谢