PICK1蛋白C端酸性区域对其功能的调节

摘要

在神经系统中，AMPAR型受体调节大多数兴奋性突触传递，因此调节突触上AMPAR的数量或功能很可能是学习与记忆的细胞生物学机制。学习与记忆主要涉及中枢神经系统的长时程变化，这种时程性变化表现为长时程增强(LTP)或长时程抑制(LTD)两种现象。长时程增强(LTP)主要通过胞外分泌插入额外的AMPAR到细胞质膜表面增强突触强度;而长时程抑制(LTD)主要内吞质膜表面的AMPAR从而减弱突触传递。PICK1(protein interacting with Cα kinase)蛋白是细胞内AMPAR循环的关键调节者。PICK1是一类存在于细胞质中的膜结合蛋白，是蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)的靶蛋白之一，也是连接激酶和膜上受体的一个衔接蛋白。小鼠来源的PICK1由416个氨基酸残基组成，包含PDZ结构域、BAR结构域和酸性氨基酸区。PDZ结构域被认为是其中的主要调节蛋白-蛋白相互作用的片段，包括受体蛋白、转运蛋白等，PICK1的BAR结构域也可与其它蛋白相互作用，如GRIP，NSC-1等，同时BAR结构域还能够识别和诱导膜的弯曲，这些相互作用在AMPAR受体循环形成过程中起到重要的作用;而对PICK1的酸性区域在AMPAR循环中可能的作用还不太清楚。
　　Ca2+是细胞内的重要的离子，细胞内外钙离子浓度水平的改变是调节诸如肌肉收缩、激素和神经递质释放、离子运输、细胞生长和分化等众多生理生化过程的重要因子，钙离子在神经活动中，在AMPAR的循环过程中也起着关键性的调节作用。本文对酸性区域以及钙离子通过与酸性区域的结合对PICK1蛋白在AMPAR的循环中的作用进行了体外分析。
　　通过基因克隆，重组蛋白的体外表达，以及利用亲和纯化、分子排阻层析，获得了PICK1截短的N-PDZ(1-110残基)，PDZ(20-110残基)，BAR（128-360残基）和BAR-C(128-416残基)重组蛋白。在此基础上利用荧光光谱技术，通过内、外源荧光检测试验，分析了C端酸性区域对其蛋白脂质结合能力和“分子开关”的构象状态的影响，同时对钙离子的调节作用进行了研究;又通过酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白-脂质覆盖法(PLO)对上述试验进行了验证。
　　通过试验表明，Ca2+通过与PICK1蛋白C端酸性区域的结合，参与调节BAR结构域与脂膜，BAR与PDZ间的相互作用。C端酸性区域对前者起到负调节作用而对后者却表现为正调节，钙离子通过与C端酸性区的结合，对两种作用作出相反的二次调节。
　　通过对PICK1蛋白酸性区域以及钙离子调节作用在AMPAR循环中影响的分析，为我们了解PICK1的性质，认识PICK1在神经生命活动中的“桥梁”作用提供了新的思路。

目录

摘要

第一章 综述

1 AMPARs 与PICK1

2 PICK 1(protein interacting with C kinase 1)蛋白结构

3 PDZ结构域：与G1uR2的C末端的结合调节AMPAR的循环

4 BAR结构域：与膜的结合调控AMPAR的循环

5 酸性区域：与钙离子的结合调节AMPAR循环

参考文献

第二章 蛋白的表达及纯化

1 前言

2 材料

2．1 主要仪器

2．2 主要试剂

2．3 菌株、质粒和免疫分析试剂

3 方法

3．1 融合蛋白MBP-BARC的表达与纯化

3．2 ProScission Protease(PPase)的表达及纯化

3．3 MBP-BARC酶切及分离纯化条件的优化

3．4 Western blot分析

4 结果

4．1 MBP-BARC的表达纯化及Western blot鉴定

4．2 MBP-BARC的酶切，分离纯化及Western blot鉴定

5 讨论

参考文献

第三章 PICK1蛋白C端酸性区域的功能

1 前言

2 材料和仪器

2．1 材料

2．2 仪器

3 方法

3．1 蛋白样品的处理

3．2 荧光光谱分析法

3．3 酶联免疫吸附法(ELISA)

3．4 蛋白质-脂类覆盖法(Protein Lipid Overlay ayassay，PLO)

4 结果

4．1 钙族不同离子(Ca2+、Mg2+、Sr2+、Ba2+)结合BARC蛋白荧光光谱

4．2．Ca2+结合在PICK1蛋白BARC结构域C-端酸性区域

4．3 C端酸性区域对BAR结构域性质的影响

4．4 Ca2+对BARC结构域功能的调节

5 讨论

参考文献

个人简历

发表论文情况

参加学术交流情况

致谢

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