拟南芥MAP激酶(MPK9)表型分析与mpk9/mpk17双突变体的构建

摘要

MAP激酶（Mitogen-activated protein kinases MAPKs）是一类广泛存在于真核生物体中的丝氨酸/苏氨酸型的蛋白激酶。MAPKs与其他一系列激酶组成MAPK级联信号通路，接受外界刺激信号后将信号转入细胞内，直接调节特定基因的表达，进而控制细胞的生物学反应。最近研究结果表明植物中的MAPKs受到植物激素以及生物、非生物胁迫的影响并参与调控细胞生物学过程的诸多方面，这些作为重要的信号因子直接参与和调控细胞的各种代谢过程并最终影响植物的生长发育。但是这两条重要的信号途径之间的相互作用机制尚不清楚。因此开展研究植物MAPKs信号途径如何参与其信号转导和调节相关基因的表达机制，将对人为控制植物的生长发育和增强植物抗性等有重要的理论和应用价值。
　　目前所鉴定的几个拟南芥MPKs均属TEY一族，有关拟南芥TDY族MPKs的报道甚少。本实验室曾经对TDY族的转座子插入突变体拟南芥MPK17进行了一系列的激素处理研究，但是激素处理后MPK17突变体与野生型之间在表型上并无显著性差异。这可能与MPK17同源基因在功能上互补或是MPK17基因功能冗余有关，因为MPK9与MPK17的基因序列具高度同源性。为此，本实验从两方面入手，一是通过对MPK9突变体mpk9的表型进行分析，以探讨MPK9的生理功能;二是构建mpk9/mpk17双突变体，即通过人工杂交方式获得稳定双突变体来探讨MPK9和MPK17基因的表达模式及二者之间可能存在的相互作用。获得主要结果如下:
　　1.应用抗性筛选法、常规PCR法及RT-PCR等方法成功筛选并鉴定出mpk9和mpk17的T-DNA插入的纯和突变体。
　　2.对mpk9进行了植物激素、非生物胁迫和光照处理。经不同浓度的IAA、NAA、2，4-D和TIBA处理后，野生型Col与突变体mpk9的根长随着处理浓度的变化而发生相应的变化，但二者之间无明显差异。在非生物胁迫处理中，无机盐浓度影响拟南芥根系的生长，即低盐浓度下可以促进拟南芥的根系生长;相反在高盐浓度下抑制了根系的延长，但不同盐浓度处理下的Col与mpk9的根长之间并无差异;在无蔗糖的处理中Col与mpk9之间有极显著差异，表明mpk9对无蔗糖有一定的抗性。在黑暗处理下抑制拟南芥根系的延长，但Col与mpk9的根长之间并无差异;在红光处理下，mpk9的根长比Col的根长有所伸长，但是两者之间无显著差异;在蓝光的处理下，mpk9与Col之间根长的差异达到了极显著水平，表明mpk9对蓝光有一定的抵抗作用。
　　3.以mpk9和mpk17纯合单突变体为亲本进行人工杂交，采用特异引物来扩增目的基因片段和T-DNA插入片段，通过比较扩增结果进行突变体的鉴定，从F2群体中成功筛选得到mpk9/mpk17纯合双突变体，其表型分析和基因功能研究正在进行中。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 植物细胞的信号转导

1．2 蛋白激酶的研究

1．2．1 蛋白质的可逆磷酸化

1．2．2 蛋白激酶的特征

1．2．3 蛋白激酶的分类

1．3 促分裂原活化蛋白激酶

1．3．1 MAPK的级联反应

1．3．2 植物体MAPK的分类

1．3．3 植物体中MAPK的作用

1．4 MAPK基因功能的研究方法

1．5 本研究的目的与意义

第二章 mpk17、mpk9单突变体的鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 主要仪器

2．1．3 试剂

2．2 实验方法

2．2．1 试剂配制

2．2．2 器皿的处理

2．2．3 植物培养

2．2．4 拟南芥总DNA的提取

2．2．5 纯合突变体植株的PCR鉴定

2．2．6 抗性筛选

2．2．7 拟南芥总RNA的提取

2．2．8 cDNA第一链合成

2．2．9 纯合突变体基因表达的RT-PCR鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 MPK17、MPK9的基因结构和T-DNA的插入位置

2．3．2 mpk17、mpk9纯合突变体的筛选

2．3．3 mpk17、mpk9纯合突变体的抗性筛选

2．3．4 mpk17、mpk9纯合突变体基因表达的RT-PCR检测

2．4 小结

第三章 mpk9纯合突变体的表型分析

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 试剂的配制

3．2．2 植物培养

3．3 结果与分析

3．3．1 激素处理

3．3．2 非生物胁迫处理

3．3．3 光照处理

3．4 讨论

3．4．1 MPK9基因对植物激素的响应

3．4．2 MPK9基因对非生物胁迫的响应

3．4．3 MPK9基因对光系统的响应

3．5 小结

第四章 mpk9／mpk17双突变体的构建与鉴定

4．1 实验材料

4．2 试验方法

4．2．1 试剂配制

4．2．2 植物培养

4．2．3 mpk9、mpk17杂交

4．2．4 F1代的鉴定

4．2．5 对F2代植株的PCR筛选

4．3 结果与分析

4．3．1 F1代的PCR检测

4．3．2 F2代的PCR检测

4．4 讨论

4．5 小结

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简况及联系方式

声明