α-氨基膦酸N衍生物及铜配合物抑制PTPs的研究

摘要

蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)在细胞信号传导方面发挥着重要的作用。生物体内酪氨酸磷酸化水平直接影响着细胞生长、分化、代谢、细胞迁移、细胞循环、细胞凋亡、基因转录、新陈代谢、离子通道的开启以及免疫应答等多个生物过程。众多研究表明，酪氨酸磷酸化水平异常，能够引起自身免疫系统和新陈代谢反应等生理紊乱现象，从而产生多种人类疾病，如Ⅱ型糖尿病、肥胖症、肿瘤、心血管疾病、免疫缺陷疾病、传染病等。因此，开展以PTPs为作用靶点进行药物研究，并探索抑制剂与PTPs作用机理，有利于研究新型的抗癌、抗糖尿病等疾病的药物。
　　本论文旨在寻找高效、低毒的α-氨基膦酸N衍生物及其对应的金属铜配合物作为PTPs的选择性抑制剂，并进一步阐述它们与PTPs的作用机理，目的是筛选出对PTPs具有高选择性、高活性的抑制剂，为抗癌、抗糖尿病药物的研究提供科学依据。主要研究成果如下:
　　1.设计合成了22种新的N端为刚性结构、柔性链和天然氨基酸残基以及环合结构的α-氨基膦酸N衍生物并运用元素分析、紫外可见光谱、红外光谱、1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR、电喷雾质谱、圆二色谱等手段进行了详细的表征。这些α-氨基膦酸N衍生物有21个含有酚羟基基团和至少一个手性C原子，手性得到圆二色光谱证实。其中五个化合物(L1-L4，L13，代码见缩略语表，下同)通过X射线单晶衍射确定结构。PTPs抑制实验表明这些有机膦化合物中，仅有七个化合物(L1-L5、L17、L20)呈现中等强度的PTPs抑制能力，且它们对不同种类的PTPs抑制能力不同，具有一定的选择性。其中抑制能力最好的是N端为刚性结构的α-氨基膦酸N衍生物L5，其对PTP1B抑制的IC50值为6.64μM，抑制能力是TCPTP的2倍，是PTP-MEG2的25倍，但是L5对SHP-1和SHP-2却几乎没有抑制能力。运用荧光滴定法研究了L5与PTP1B的结合作用，结果表明，L5能够与PTP1B有效结合并引起PTP1B荧光猝灭，形成1∶1型复合物，结合常数为2.23×105 M-1。同时细胞实验表明，L5能够抑制HepG2细胞增殖和影响其凋亡，但是它对细胞的毒性相对较低。这些结果均表明α-氨基膦酸N衍生物有可能是低毒选择性的PTPs抑制剂。
　　2.以上述所合成的α-氨基膦酸N衍生物为配体，成功得到五个新的有机膦双核铜配合物1-5([Cu2(DPMP)2](1)，[Cu2(DEMP)2](2)，[Cu2(DHMP)2](3)，[Cu2(D-5-Cl-PMP)2](4)，[Cu2(D-5-Br-PMP)2，(5)])。运用元素分析、红外光谱、X射线单晶衍射、电子顺磁共振光谱、变温磁化率、紫外-可见光谱、pH电位滴定、电喷雾质谱等测试手段对其固体和溶液的组成、谱学、结构等进行了详细表征。晶体结构分析表明，配合物1&2的晶体属于三斜晶系，空间群为P(i)，两个Cu离子与两个有机膦配体配位构成双核配合物，内部形成了一个双桥基（μ1,3-O，O'）双铜8元环，每个铜离子与两个N及P上的两个O以及来自另外一配体P上的一个O配位形成畸变的四方锥构型。电喷雾质谱、动力学实验和pH电位滴定分析结果均表明，溶液状态下有机膦双核铜配合物1-5能够以双核配位形式稳定存在。PTPs活性筛选实验表明，双核铜配合物1-5能够有效的抑制PTP1B和TCPTP的活性，IC50在0.16(4)-0.36(3)μM范围，抑制SHP-1的IC50在1.1(1)-1.8(4)μM范围，抑制SHP-2的IC50在5.7(1)-6.7(2)μM范围，但是配合物1-5对PTPMEG2的抑制IC50在22.7(3)-38.3(5)μM范围，由此得出配合物1-5能有效并选择性抑制PTPs。酶促动力学实验指出，配合物1-5对PTPs抑制能力的大小不同与抑制模式无关，可能与PTPs自身的结构特点有关。荧光滴定实验表明，[Cu2(DPMP)2](1)能够与PTPs结合形成1∶1型复合物，对PTP1B，TCPTP，SHP-1，SHP-2，PTP-MEG2的结合常数分别为1.62×106，3.09×106，1.95×105，2.24×105，1.55×104M-1，由此得出抑制能力的大小与结合能力的强弱有关。此外，配合物1-5不仅能有效抑制重组的PTPs的活性，同时也能很好的抑制C6胶质瘤细胞提取物中PTPs的活性。值得一提的是，运用EPR光谱分析[Cu2(DPMP)2](1)在空气中含GSH的MOPS(pH=7.2)缓冲溶液、不含GSH的MOPS(pH=7.2)缓冲溶液、固态以及无氧条件下含GSH的MOPS(pH=7.2)缓冲溶液中的铜离子的氧化态，结合有氧无氧以及含与不含GSH测得的IC50值，我们得出[Cu2(DPMP)2](1)抑制PTP1B的活性可能与[Cu2(DPMP)2](1)中铜离子的氧化态有关，而不是因为铜促进‘Fenton’反应产生氧物种致使PTP1B活性位点氧化失活。这些结果表明有机膦双核铜配合物能够通过抑制PTP1B的活性参与细胞信号转导且不产生氧活性物种毒害细胞。我们也尝试了PTP1B蛋白晶体浸泡不同浓度的[Cu2(DPMP)2](1)，浸泡前获得分辨为2.2(A)衍射数据，解出2-292个氨基酸残基，但浸泡后未能获得好的蛋白晶体衍射数据。
　　此外，变温磁化率研究表明，[Cu2(DPMP)2](1)和[Cu2(DEMP)2](2)中两个金属铜之间表现为反铁磁耦合。
　　3.获得一系列新的具有双四环(double four ring，D4R)构型的有机膦铜配合物6-9(Na4[Cu4(HMPA)4]·16H2O(6·16H2O)、[Na4Cu4(HEPA)4]·xH2O(7·xH2O;7a x=19,7b x=16)、Na2[Cu4(HHPPA)4]·8H2O(8·8H2O)、Na2[Cu4(HEPA)4Cu(H2O)4]·6H2O(9·6H2O)),并用元素分析、红外光谱、电子顺磁共振光谱、X射线单晶衍射、X射线粉末衍射、电喷雾质谱、圆二色光谱、热重分析、变温磁化率分析、二次谐波产生(SHG)、气体吸附等测试手段对所合成的配合物进行了表征及对五种PTPs的抑制活性和具有D4R构型的有机膦铜配合物的物理化学性质研究。X射线单晶衍射结构分析表明，配合物6-9的共同特点是由4个Cu与4个P通过8个O连接构成一个D4R核结构，四个Cu(Ⅱ)离子通过四个α-氨基膦酸配体桥连，形成四价配合物阴离子与4个Na离子结合达到电中性，每一个Cu(Ⅱ)离子均是五配位，构成畸变的四方锥型。此外，四价配合物阴离子之间通过-O-Na-O-Na-O-连接为三维结构。这些具有D4R核结构的铜配合物不仅能以竞争模式有效和选择性抑制PTPs的活性，同时还能抑制C6胶质瘤细胞提取物中PTPs的活性，与双核铜配合物的抑制作用相比，多核铜配合物显著提高了对SHP-1的抑制活性，提高了约10倍;而对PTPMEG2，抑制能力却降为双核铜的十分之一;从整体上看，多核铜配合物对PTP1B，TCPTP, SHP-2的抑制能力较双核铜均有一定的提高。这说明通过合理设计铜配合物的结构，有可能筛选出只对某一种PTP具有高效特异抑制能力的抑制剂。
　　根据这些α-氨基膦酸N衍生物具有手性C和其铜配合物具有D4R核结构的特点，我们对其圆二色光谱、二次谐波产生、变温磁化率及气体吸附等性质做了进一步研究。结果表明:1）它们都具有CD活性;2）二阶谐波效应(SHG)是尿素的0.3-0.5倍;3）D4R核结构的有机膦铜配合物铜与铜之间存在反铁磁耦合作用;4）配合物7b对N2气体有吸附作用。